用蚀斑试验测定病毒贮液的滴度实验4

95% 酒精胰酶含 5%小牛血清的 Eagle

细胞培养板

(1) 用细胞培养板 (6孔)，若用旧板，洗净后浸于 95% 酒精中5 min, 再用紫外线照射 2-4 h备用，新板可直接使用。

(2) 将传代细胞系经胰酶消化分散后，用含 5%小牛血清的 Eagle 将细胞配成 3 X 10⁵/ml(依细胞种类而定)。

(3) 按每孔 3ml 加入细胞悬液，在 37℃ 5% CO₂ 培养箱中培养 24 h 或 48 h, 直至形成单层。

(4) 除去生长液，每孔加入 0.1 ml 不同稀释度病毒，然后将此板于 37℃5% CO₂培养箱中吸附1 h 。

(5) 将双倍营养覆盖液与等量融化的 2% 琼脂水溶液混匀，并维持于 45-50℃防凝。双倍营养覆盖溶液配制： 4 ml 灭活胎牛血清， 20 ml 10倍浓缩 Eagle, 13. 3 ml 1%酵母浸液－5% 水解蛋白水溶液， 6 ml 7. 5% NaHC0₃( 水配）， 2 ml 双抗（水配）， 54. 7 ml 无菌三蒸水，加入等量 56℃已融化的 2%琼脂水溶液并摇匀。

(6) 融化的营养琼脂覆盖层液在 45-50℃下每孔加 3ml, 待冷凝后倒置于 37℃5% CO₂ 培养箱内培养。 1~5 d 后再加第二层染色覆盖层（依病毒种类而定），其中含有 1 : 25 000 的中性红，继续培养于暗处，定期检查空斑情况。