实验材料 | |
---|---|
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 一、原虫包囊和虫卵的保存 汞碘醛液10 ml与粪便1 g混匀后密封在瓶内,可保存其中的原虫包囊及虫卵数月之久,也可在经浓集法处理的粪便沉渣中加等量或1倍量的10 %甲醛液(加热至70 ℃),摇匀,用石蜡封固瓶口。 二、蠕虫成虫的保存 1. 线虫
2.吸虫 固定一般用10 %甲醛,24小时后移至5 %甲醛中保存;或用70 %酒精固定0.5~3小时,视虫体大小而定,再移至新的70 %酒精中保存。 3.绦虫 三、昆虫的保存 1. 干标本保存系保存有翅昆虫成虫。
图1 有翅昆虫针插法 2. 湿标本保存用于保存有翅昆虫的卵和幼虫期及无翅昆虫和蜱螨类的发育各期。 所有保存标本须详细记录标本名称、宿主、采集地点、采集日期及采集者姓名。 樟脑混合剂配制:樟脑粉6份,氯仿1份,木馏油1份,石蜡油4份。先将樟脑粉1.5份与氯仿1份混合,随后加樟脑1.5份与木馏油1份,用玻璃棒混匀,最后加樟脑粉3份及石蜡油4份,再搅匀备用。此混合剂易燃,宜置于严密而不透气的瓶内储藏。 常用固定液配制: ⑴酒精:通常用70 %或75 %酒精为固定液。用商品供应95 %酒精作稀释配制。取95 %酒精加至需要稀释的浓度,再加蒸馏水到95 ml即可;或者,可按下列稀释。 所需酒精浓度/原酒精浓度×配成酒精量=所需原酒精量(ml)
配成酒精量-所需原酒精量=应加蒸馏水量(ml) ⑵福尔马林(37 %~40 %的甲醛水溶液) ⑶布氏(Bless)液:福尔马林原液7 ml,酒精(70 %)90 ml,冰醋酸(临用前加入)3~5 ml混合配成。 四、原虫低温保存 用液氮保存原虫,具有保持原虫生物学特性,且保存时间较长的优点。现仅介绍疟原虫、弓形虫、人毛滴虫及阴道毛滴虫的低温保存方法。 1. 冻存方法 恶性疟原虫:将从受染者采得的抗凝含虫血或体外培养的培养物,经1500 rpm离心10分钟,加入与沉积细胞等量的24%二甲基亚砜(DMSO)生理盐水溶液(0.9 %生理盐水或5 %葡萄糖生理盐水76 ml中加入DMSO 24 ml)保护剂,充分混匀后在室温中放置30分钟,按0.5~1.0 ml分装入无菌安瓿(或塑料管)内,封口(或盖严)后将之放入标明批号的纱布袋中,装于液氮罐的提筒内,先置于液氮罐的颈部,该处约为-70 ℃,30分钟后,置液氮中(-196 ℃)冻存。 鼠疟原虫:从感染疟原虫第3~4天的小鼠心脏取血(或摘除眼球取血),注入试管,肝素抗凝,加入等量的10 %或15 %DMSO及15 %或20 %小牛血清为保护剂;或加入等体积的甘油、山梨醇保护液(4.2 %山梨醇生理盐水180 ml加纯甘油70 ml),充分混匀。按照上法装管及冻存。也可以在1 mm3阳性鼠血加0.1 mm3的3.8 %枸橼酸钠抗凝之后就装于液氮罐提筒中,立即直接置液氮中保存,2年内多数原虫仍有活力。 弓形虫:用无菌注射器吸取10 %DMSO 2 ml,注入感染4天的小鼠腹腔,抽洗2次,抽出液混匀后即注入无菌塑料管内(0.5~1 ml/管),冻存法同上。 阴道毛滴虫:用无菌拭子取阴道分泌物,放入培养基中培养48小时,转种于RPMI-1640培基中2天。取含虫培养液经1000 rpm/min离心10分钟,在沉淀中加入10 %DMSO 2 ml,同上法分装及冻存。 人毛滴虫:取腹泻患者的含虫粪便培养于洛氏培养基中48小时,转种于洛氏培养基或RPMI-1640培养基中培养2天后计算虫数(达7×105)。加等量10 %DMSO并加Tween-20于DMSO中。装管同上法。但冻存过程应先将小管置于-10 ℃中15分钟,移到液氮罐颈2分钟,再置入液氮中冻存。 上述所用的保护剂(液)均应经高压灭菌,保存于4 ℃冰箱。RPMI-1640配制50 %DMSO,用时再稀释所需浓度,加15 %或20 %小牛血清,调pH至7.2。 2. 复苏与观察 |