一、材料仪器设备及试剂
1. 材料:水稻或小麦的叶片、幼穗等。
2. 仪器设备:冷冻离心机;分光光度计;电子分析天平;冰箱;恒温水浴;研钵;剪刀;离心管;具塞试管;移液管;洗耳球。
3. 试剂及配制:
1μg·ml-1亚硝态氮标准母液配制:准确称取分析纯NaNO2 0.9857g,溶于蒸馏水后定容至1000ml,然后再吸取5ml定容至1000ml,即为含亚硝态氮1μg·ml-1的标准液。
0.1mol·L-1pH7.5的磷酸缓冲液配制:称取Na2HPO4·12H2O 30.0905g与NaH2PO4·2H2O 2.4965g,加蒸馏水溶解后定容至1000ml。
1%对-氨基苯磺胺(W∕V)溶液配制:称取1.0g磺胺溶于100ml 3mol·L-1HCl中(25ml浓盐酸加蒸馏水定容至100ml即为3mol·L-1HCl)。
0.02%(W∕V)萘基乙烯胺溶液配制:称取 0.0200g萘基乙烯胺溶于100ml蒸馏水中,贮存于棕色瓶中。
0.1 mol·L-1KNO3溶液配制:称取 2.5275g KNO3溶于250ml 0.1mol·L-1pH7.5的磷酸缓冲液。
0.025 mol·L-1pH8.7的磷酸缓冲液配制:称取 8.8640g Na2HPO4·12H2O,0.0570g
K2HPO4·3H2O溶于1000ml无离子水中。
提取缓冲液配制:称取 0.1211g半胱氨酸,0.0372gEDTA溶于100ml 0.025 mol·L-1pH8.7的磷酸缓冲液中。
2mg·ml-1NADH(辅酶Ⅰ)溶液配制: 4mg NADH溶于2ml 0.1mol·L-1pH7.5的磷酸缓冲液中(临用前配制)。
二、实验步骤
1. 亚硝态氮标准曲线制作
(1)取7支15ml刻度试管,编号,按下表配制含量为0-2.0μg的亚硝态氮标准液。
加入表中试剂后,摇匀,在25℃下保温30min,然后以0号管为空白对照,在520nm波长处测定吸光度(A)值 。
(2) 标准曲线绘制
以1~6号管亚硝态氮含量(μg)为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。
2. 样品中硝酸还原酶活力测定
(1) 酶的提取
称取0.5g鲜样,剪碎于研钵中置于低温冰箱冰冻30min,取出置冰浴中加少量石英砂及4ml提取缓冲液,研磨匀浆,转移于离心管中,在4℃,4000r/min下离心15min,上清液即为酶提取液。
(2) 酶促反应
取酶液0.4ml于10ml试管中,加入1.2ml 0.1 mol· L-1KNO3磷酸缓冲液和0.4ml NADH溶液,混匀,在25℃水浴中保温30min,对照不加NADH溶液,而以0.4ml 0.1mol·L-1pH7.5的磷酸缓冲液代替。
(3) 酶活性测定
保温结束后立即加入1ml 1﹪磺胺溶液终止酶反应,再加1ml 0.02﹪萘基乙烯胺溶液,显色15min后于4000 r / min下离心15min,以空白管为对照,取上清液在520nm波长处测定吸光度(A)值。
三、 酶活性计算
根据样品所测得的吸光度(A)值,从标准曲线查出反应液中亚硝态氮含量,按下公式计算样品中酶活性:
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