核型分析

实验概要

核型分析

实验原理

因为染色体在细胞周期分裂期的前期开始凝集，所以对阻滞于有丝分裂中期的细胞进行核型检测，这时的染色体已完成凝集，形态上容易辨认。秋水仙素可以破坏微管装配，使纺锤体不能形成，使大量细胞停止在分裂中期；低渗作用使水进入细胞内，细胞内空间变大，染色体间的距离拉大，易于染色体展开；固定液使蛋白质变性，染色体内的组蛋白变性后硬度增加，有利于染色体形态的保持，细胞膜蛋白变性使细胞膜硬度增强，形成屏障作用，防止了细胞内物质外溢和丢失。

主要试剂

20 μg/mL秋水仙素、0.56% KCl(w/v)、核型固定液、核型用磷酸缓冲液、Giemsa染液

实验材料

15 mL离心管、移液管、载玻片、染色盒、核型分析仪

实验步骤

①在细胞培养液中按1∶200加入20 μg/mL秋水仙素至终浓度为0.1 μg/mL，细胞正常培养条件下处理2～4 h。
注意：细胞在分裂间期染色质凝集，为了方便检测核型，需要使细胞处于分裂间期。秋水仙素可以使细胞停滞于有丝分裂中期，但并不是阻滞时间越长越好，一般2～4 h为宜。
②将0.1 M KCL低渗液预热至37℃。
③取出培养瓶/皿，加入0.25%胰蛋白酶将细胞消化成单细胞悬液。
④将细胞悬液转移至15 mL离心管，1000 r/min室温离心10 min，弃上清。细胞沉淀中加入4 mL事先预热至37℃的0.1 M KCl低渗液，用滴管吹打成单细胞悬液，37℃低渗处理15～20 min。
注意：低渗处理非常关键。低渗处理不充分，细胞膨胀不充分，影响最后染色体的平铺;低渗处理时间过长，会使细胞提前破裂，使溶液中存在散在的染色体。
⑤配10 mL核型固定液，4℃冰箱预冷。
⑥加入1 mL预冷的核型固定液，轻轻吹匀（用滴管从上到下吹吸10次）后1000 r/min 4℃离心10 min。
⑦弃上清，加4 mL新鲜预冷的核型固定液（一个3.5 cm培养皿的细胞加4 mL核型固定液），轻轻吹打成单细胞悬液，放入4℃冰箱固定30 min以上。
⑧4℃ 1000 r/min离心10 min。
⑨配8 mL的核型固定液，4℃冰箱预冷。
⑩重复第⑦、⑧步两次。
⑪弃上清，加入少量核型固定液（0.2～0.6 mL）重悬细胞。
⑫取一洁净载玻片，用滴管吸取细胞悬液，于载玻片垂直上方50 cm以上处滴片，将载玻片倾斜放置，自然晾干（1 h以上）。
⑬配10 mL Giemsa染液。
⑭将载玻片倒扣（染色体面向下）于染色盒内，于载玻片和盒内壁之间加入染液，室温染色1 h（如果染色程度不够，可加入新鲜配制的染液再染1 h）。
⑮将载玻片取出，于自来水中冲洗0.5～1 min，再用蒸馏水冲洗5 s，自然晾干。
⑯显微镜下观察、计数。每个核型数3次，载玻片沿前后方向移动，再沿左右方向换视野，左右两视野间要有1/2重叠。每个样品要数50个以上核型。