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专一性和温度、pH、激活剂及抑制剂对淀粉酶活性的影响

2019.4.18
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184****5725

致力于为分析测试行业奉献终身

实验概要

本实验介绍了唾液淀粉酶的收集与处理方法,淀粉酶的专一性和温度、pH、激活剂及抑制剂对其酶活性的影响。

实验原理

酶具有高度专一性,一种酶只能催化一种或一类底物发生反应,如淀粉酶只能水解淀粉,不能水解蔗糖。当淀粉被淀粉酶彻底水解为还原性麦芽糖和葡萄糖时,能使班氏试剂的Cu2 还原成Cu1 ,生成砖红色Cu2O沉淀。淀粉酶的活性受温度、pH、激动剂及抑制剂、酶浓度以及作用时间等多种因素影响,因而水解淀粉生成一系列分子大小不同的糊精。不同程度的水解糊精可与碘反应生成紫色、棕色或红色络合物。通过上述特征性反应,并以蔗糖等作对照,便可观察、验证淀粉酶是否具有专一性以及它的催化活性是否受到影响。

主要试剂

1. 1%淀粉称取淀粉1g,加少量水调成糊状,加入煮沸的0.3%NaCl溶液至100ml。

2. 1%蔗糖溶液

3. 班氏试剂 A液:取柠檬酸钠173g,无水碳酸钠100g,加水600ml,加热溶解,冷却后稀释至850ml;B液:取结晶硫酸铜(CuSO4·5H2O)17.3g溶于100ml预热的蒸馏水中,冷却后加水至150ml。将A液缓慢倒入B液中混匀置试剂瓶备用。

4. 碘液:称取碘4g、碘化钾6g溶于l000ml蒸馏水中,置棕色瓶内贮存备用。

5. 各种pH缓冲液

   1) pH6.8缓冲液:取0.2mol/LNa2HPO4溶液772ml,0.1mol/L柠檬酸溶液228ml混合即成。

   2) pH4.0缓冲液:取0.2mol/LNa2HPO4溶液385.5ml,0.1mol/L柠檬酸溶液614.5ml混合即成。

   3) pH8.0缓冲液:取0.2mol/LNa2HPO4溶液972ml,0.1mol/L柠檬酸溶液28ml混合即成。6.0.9% NaCl 溶液

6. 1%CuSO4 溶液

7. 1%Na2SO4溶液

主要设备

1. 滴管、烧杯、试管(架)及试管夹。

2. 恒温水浴箱与水浴锅。

3. 脱脂棉、漏斗及纱布。

4. 白瓷反应盘。

实验材料

待测淀粉酶

实验步骤

1. 唾液淀粉酶的收集与处理

   1) 制备唾液
实验者先将痰咳尽,用自来水漱口,以清除口腔内食物残渣,再在口腔内含蒸馏水约15ml,并作咀嚼咕漱运动,3分钟后吐入垫有两层经润湿处理的脱脂纱布的漏斗内,过滤于小烧杯中备用,为与下面稀释唾液相区别,此称制备唾液。
   2) 煮沸唾液
取上述唾液约2ml,盛入1中号试管中,置沸水浴煮沸5分钟备用。
   3) 稀释唾液
调整唾液淀粉酶活性,使之在pH6.8、37℃和既无激动剂又无抑制剂条件下,作用5min,水解淀粉至红色糊精为宜。具体做法是取12凹白瓷反应板一块,按下列步骤操作:
      a. 第1排每凹各加1滴制备唾液,12、13、14凹分别加生理盐水1、2、3滴,用滴管采用抽吸法,由稀到浓(14→12)小心混匀各凹,勿使溅入相邻凹中。每混匀一凹便取其1滴放入同列的2排凹中,剩余稀释唾液应全部放回原凹中。
      b. 在盛有不同稀释度唾液的第2排各凹中,均加入4滴缓冲液(pH6.8),2滴1%的淀粉液和2滴蒸馏水,用a混匀法充分混匀,置37℃下5min。
      c. 在第2排各凹中加I液一滴,混匀,观察比较各凹颜色,以浅棕-红色对应的稀释倍数,用生理盐水稀释3ml制备唾液备用。

2. 唾液淀粉酶的专一性以及温度、pH、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活性影响的观察

   1) 取试管3支编号,按下表1操作

表1 唾液淀粉酶专一性的实验观察

试剂

试管

pH6.8缓冲液

1%淀粉溶液

1%蔗糖溶液

制备唾液

煮沸唾液

1

20滴

10滴

5滴

2

20滴

10滴

5滴

3

20滴

10滴

5滴

将上述各管混匀后,置37℃水浴中保温10分钟,然后每管加入班氏试剂20滴,再放入沸水浴中煮沸约15分钟,观察各管颜色反应,并说明原因。

   2) 温度影响酶促反应的实验观察

     a. 取试管3支编号,按下表2操作:

表2 温度影响酶促反应的实验观察

管号

试剂

1

2

3

1.pH6.8缓冲液

20滴

20滴

20滴

2.1%淀粉溶液

10滴

10滴

10滴

3.预热5min

37℃水浴

沸水浴

冰浴

4.直接加入稀释唾液,立即混匀、计时

5滴

5滴

5滴

5.保温10min

37℃水浴

沸水浴

冰浴

      b. 将一、二管移入冰水浴中,待各管温度一致后速向各管加入碘液1滴,混匀后观察各管颜色的区别,并说明温度对酶促反应的影响。

   3) pH影响酶促反应的实验观察

      a. 取试管3支编号,按下表3操作:

表3 pH影响酶促反应的实验观察


pH4.0缓冲液

pH6.8缓冲液

pH8.0缓冲液

1%淀粉溶液

稀释唾液

试管1

20滴

10滴

5滴

试管2

20滴

10滴

5滴

试管3

20滴

10滴

5滴

      b. 将上述各管混匀后,置37℃水浴中保温10分钟,然后每管加入碘液1滴,混匀后观察各管颜色的区别,并说明pH对酶促反应的影响。

   4) 激动剂和抑制剂影响酶活性的实验观察

      a. 取试管4支编号,按下操作:

表4 激动剂和抑制剂影响酶活性的实验观察


pH 6.8

缓冲液

1%淀粉溶液

蒸馏水

0.9%NaCl

1%

CuSO4

1%Na2SO4

稀释唾液

1

20滴

10滴

10滴

5滴

2

20滴

10滴

10滴

5滴

3

20滴

10滴

10滴

5滴

4

20滴

10滴

10滴

5滴

      b. 将上述各管放入37℃水浴中保温10分钟,然后每管加入碘液1滴,混匀后观各管颜色的区别,并说明激动剂和抑制剂对酶促反应的影响。

注意事项

1. 反应试管应清洗干净,不同酶液、试剂及其滴管不能交叉混用;

2. 使用混合唾液,或通过预试选出合适的唾液稀释度,效果更为显著。


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