实验概要
机械力在生物过程中发挥着显著作用。这些机械力可以通过骨架长丝网络传送到细胞，诱导胞浆内不同的生化反应。虽然已经有充足的报告显示，细胞质酶可被细胞表面的局部应力直接激活，但一直没有证据表明，机械力可以直接改变核功能，包括卡哈尔体蛋白质复合物的结构变化。本实验描述了通过利用磁场扭曲力改变，流式细胞仪与荧光共振能量转移（FRET）监测哈尔体蛋白质的动态变化和相互作用。
主要试剂
Coilin的CFP和YFP质粒探针,SMN，fibrillarin，Nopp140，WRAP53，SART3，SmE，SmG((Miroslav Dundr，Rosalind Franklin University of Medicine and Science，North Chicago)
mCherry-Lamin 质粒( Peter Kalab，National Institute of Health)
HeLa细胞(ATCC)
Lamin A/C -/- (LMNA-knockout) mouse embryonic fibroblast (from Colin Stewart，National University of Singapore，Singapore)
Plectin -/- mouse fibroblast (from Gerhard Wiche，University of Vienna，Germany)
二氧化碳独立的培养基(Invitrogen公司)
胶原蛋白，老鼠尾巴得到 I型(solution，Sigma，091M7675)
Ferromagnetic 珠(Fe3O4的；直径4.5微米)( W. Moller，Gauting，Germany or J. Fredberg，Boston，MA; magnetic beads with various surface properties are commercially available in an assortment of sizes from Spherotech，Inc.，Lake Forest，IL)
二甲基亚砜，无菌过滤(DMSO，Sigma)
胎牛血清(FBS； Hyclone)
Opti-MEM培养基( Invitrogen)
青霉素，链霉素(Invitrogen)
磷酸盐缓冲液(PBS; Hyclone)
L-谷氨酰胺(100X)(Invitrogen)
脂质体2000(Invitrogen)
Trolox (6-Hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid; Sigma)
2％的Bis 溶液(Bio-Rad Laboratories，161-0142)
40％的丙烯酰胺溶液(Bio-Rad Laboratories，161-0140)
3-aminopropyltrimethoxysilane (Aldrich，Product # 281778)
0.5％gluteraldehyde(Sigma-Aldrich，Product # G6257)
10％过硫酸铵(APS，Bio-Rad)
TEMED(Bio-Rad)
HEPES (Sigma)
磺酸基-SANPAH(Pierce，Product # 22589)
0.2μm的萤光乳胶颗粒(分子探针)
0.05M碳酸盐缓冲液(pH 9.4; bioWORLD)
玻璃底培养皿(直径35毫米;细胞E＆G)
12毫米圆形盖玻片Fisher，cat. # 12-545-80)。
Synthetic RGD-containing peptide [Ac-G(dR)GDSPASSKGGGGS(dR)LLLLLL(dR)-NH2
Peptide-2000 (Telios) (18); Peptides International，Inc.，Louisville，KY]
实验步骤
用RGD涂层磁珠：
1．将磁珠悬浮于95％的酒精中(杀菌)，然后分装到2毫升小瓶内，每瓶含珠子1mg 。
2．打开一小瓶让酒精蒸发。
3．加入的1.5毫升PBS缓冲液冲洗珠子。离心，并小心弃掉PBS。
4．加入1mL碳酸盐缓冲液。
5．添加50μg RGD肽(用二甲基亚砜稀释)到珠子缓冲液中。
6．震荡珠，4℃过夜。
7．使用珠子前，离心，弃RGD上清，然后用PBS冲洗一次，如第3步。
8．将磁珠存储在无血清培养液DMEM中。
细胞培养和转染
1．实验中使用的所有细胞都倾向于低通道。
2．常规细胞培养于T-25培养瓶中，培养液为DMEM包括： 10％FBS，100U /毫升青霉素，100μg/mL的链霉素，和2mM L-谷氨酰胺，37℃， 5％CO2培养箱中培养。
3．进行细胞实验，需要提前3天准备。第1天，用胶涂满玻璃瓶底，4℃过夜，使玻璃表面吸收的胶原蛋白。
4．第2天，将胶原蛋白涂层的培养瓶在紫外光照射下照射10分钟消毒。细胞(〜300，000)在35毫米的胶原蛋白涂层培养瓶中，第2天将达到80％融合。
5．第3天，用CFP和YFP的标记蛋白的质粒结构双转染细胞。稀释1μg CFP质粒和1μgYFP质粒至100μg Opti-MEM I 培养基的小瓶内。
6．在另一个小瓶中，加入4μL脂质体2000至Opti-MEM I培养基的小瓶内。
7．将两小瓶的内容混合在一起前，在室温下等待5分钟，然后再等待20分钟。
8．加入200μl的DNA -脂质体混合物至含有细胞的培养瓶中。
9．可选：为了尽量减少漂白，加入0.05mM Trolox和DNA -脂质体混合物至培养瓶。
10．37℃，5％CO2培养箱中孵育6小时，更换培养基培养液培养。
11．第4天，细胞转染，并准备成像
磁扭仪(MTC)：
1．在第4天，取出培养瓶弃掉大部分培养液，只有在中心(玻璃地区)的细胞被培养基覆盖。
2．加入20μLRGD涂层的磁珠(20微克)分散使其铺满培养瓶中央区。
3．小心地将珠进入孵化器10分钟，以便整合集群和周围的珠子粘连。
4．从孵化器中拿出细胞，用PBS冲洗一次。以及避免中心的细胞分散。轻轻的加入PBS并从另一边倒掉。
5. 当细胞置于显微镜下下时，为了维持细胞培养的pH值，像培养箱中加入CO2。
6. 将培养瓶放置在MTC的阶段。然后将其放置在倒置显微镜下。
7．找到被CFP和YFP质粒转染的单细胞，细胞也需要一个珠子与它连接。弃掉所有未转染细胞，有一个以上的珠连接的细胞，或与相邻细胞接触的细胞。
8．找到良好的细胞后，运用强大的电磁脉冲(〜1000G，<为0.5ms)磁化磁珠。
9．珠子被极化和磁化，利用垂直方向的磁场脉冲磁化，这将导致珠旋转。输入MTC的参数。FRET分析的应力峰值幅度通常为17.5Pa(50G step load)或其他的幅度，相位滞后分析为24.5Pa(70G oscillatory load)。
10．利用压力，捕捉必要的光或荧光图像。
共振成像分析：
1．对于共振成像，双视角成像系统被用来分裂成两个(1344×512每像素)的位象。顶视图捕捉YFP，而底视图捕捉CFP。
2．利用MTC，FRET双视图的时间轴图像捕获监视细胞核内蛋白质与蛋白质之间相互作用。
3．实验完成后，并获得图像。利用Matlab程序分析数据。程序分为顶部的(YFP)和底部的(CFP)的位像。
4．选择有效的区域(在我们的例子中的CB)，程序通过从CFP和YFP的图像定格区域，然后通过交叉关系对齐
5．使用Matlab的“graythresh”二进制掩码创建CFP和YFP的图像。二进制掩码，然后乘以荧光图像生成的图像，有荧光区域和黑色的背景。
6．计算CFP / YFP的比率值，每个像素已对齐和交叉相关，取得和报告的区域的平均值。每个图像或时间点会产生一个CFP / YFP的价值。
聚丙烯酰胺凝胶牵引力的测量：
1．聚丙烯酰胺(PA)与0.2μm的荧光珠凝胶用来衡量每个细胞产生的牵引力。由双丙烯酰胺的浓度不同，可以得到不同的凝胶刚度
2．准备PA凝胶，超过在35毫米的玻璃瓶底表面使用尖棉拭子涂抹3-aminopropyltrimethoxysilane，等待6分钟。
3．用清水洗净，然后加入100μL/每瓶 0.5％ gluteraldehyde，静止30分钟。
4．彻底清洗一遍，干燥。整个凝胶避免接触玻璃表面。
5．判断之二：丙烯酰胺溶液的比例，以获得所需的凝胶的刚度。0.6，2和8 KP，0.06％的双丙烯酰胺和3％的丙烯酰胺，0.05％双丙烯酰胺和5％的丙烯酰胺，0.3％的双丙烯酰胺和5％的丙烯酰胺分别对应。在2毫升小瓶内准备1毫升每个所需的混合物。
6．加入10μL的0.2μm的荧光珠至双丙烯酰胺的混合物。加入荧光珠之前，请务必涡流或超声粉碎。
7．加入聚合激活物/启动子至珠双丙烯酰胺的混合物。10％APS 体积比为1：200(在这种情况下，5μL)TEMED体积比为1：2000(在这种情况下，0.5μL)。彻底混合在一起。
8．加入15μL混合物到处理玻璃瓶的表面。(15μL将给予75μm 厚的基板)。
9．12mm 的圆形盖玻片压平。
10．转动的玻璃底部盘，使其倒挂。这可以确保荧光珠接近顶面。
11．放入培养箱孵育30-45分钟。高温有助于在聚合。
12．凝胶完全聚合后，用100mM的 HEPES冲洗。 的菜肝素钠。然后单刃剃须刀小心地移走圆形玻璃盖。
13．制备1mM的SANPAH溶液，含二甲基亚砜和100mM的 HEPES。添加二甲基亚砜到SANPAH先溶解固体粉末，然后将它添加到 HEPES 。
14．从玻璃瓶底吸出HEPES，用金湿巾吸取周围凝胶边缘。
15．应用200μL SANPAH溶液凝胶。
16．暴露表面于紫外线下6分钟(离灯6“)激活凝胶表面。SANPAH颜色会转暗，没有SANPAH处理，胶原蛋白不会绑定到凝胶表面。
17．用100mM的 HEPES冲洗掉SANPAH。
18．再次重复照片激活和冲洗过程，不少于一次，用100mM的 HEPES冲洗。
19．凝胶表面用所需浓度的胶原蛋白涂抹，4℃孵育过夜。
20．将细胞接种于凝胶表面前，在紫外光下消毒10-15分钟。
21．PA凝胶可4℃存储在PBS中三个星期。
注意：要确定所需的基板刚度与双丙烯酰胺的比例，参考文献23-25。
牵引力显微镜(TFM)：
1．细胞培养在PA凝胶上。根据PA凝胶刚度，细胞会产生不同的牵引力，从而不同程度的变形。
2．需要捕获三幅图像。首先是用于识别细胞边界的光学或相衬图像。二是荧光磁珠标记的图像，细胞仍然是在基板上。三是参考荧光磁珠标记的图像，从凝胶表面的细胞已被移除或胰酶消化。
3．一个自定义的Matlab程序来分析产生的牵引力。通过比较荧光珠位置前和胰蛋白酶消化后，确定由每个体细胞的牵引力引起的位移场。
4．其中flourecent图像划分成小窗口区域用来确定位移向量。
5．基于Boussinesq液，利用Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC) 的均方根(RMS)的牵引场，计算出位移场。
细胞刚度测量：
1．应用细胞压力(Pa)计算扭转磁场(G)，乘以常数(PA / G)和应用的珠扭场(G)。珠常数反映珠的磁属性和批次，批次可能会有所不同。他们浸泡在一个已知的粘性液体，并申请一个恒定的磁场，同时测量残余的磁场。例如，一个50 G对细胞产生17.5帕的压力，如果细胞珠常数为0.35 PA / G9。
2．当在显微镜下观察到顶端附着磁珠的细胞，MTC的震荡应力为0.3 Hz。
3．MTC软件跟踪磁珠的位移坐标，并保存在一个文本文件。
4．通过量化磁珠位移和磁珠嵌入领域，细胞的复模量可被估计。用自定义的Matlab程序，计算细胞的刚度。
5．磁珠的位移波同步的选择输入正弦信号，筛选出珠子或显微镜位移转变的自发运动。
6．磁珠位移小于5 nm(检测结果)和松散结合的磁珠未被选择进行分析。为了增强信号噪音比，位移的峰值幅度超过每个细胞5个连续周期。
7．应用方程G * = T / D计算复杂的刚度。对于每个珠子，根据相位滞后计算弹性刚度G、(G*的实部)和耗散刚度G”( G *的虚部)。测量刚度为扭矩单位每单位珠位移(PA /纳米)。
8．基于细胞表面接触珠，用有限元模型转换细胞刚度(PA /纳米)至模量(PA)。(如图1)
9．关于如何计算刚度的更多细节已被 Fabry Bet. 等描述。
相位滞后量化：
1．振荡应力(0.3 Hz或0.83 Hz)应用于较好转染的细胞，类似于用来测量细胞刚度应力。
2．磁珠的时间位移，捕获CFP标记蛋白，YFP标记蛋白时，应用循环应力。
3．自定义的Matlab程序用于分析图像和珠位移，决定CFP和YFP的标记蛋白质。计算磁珠荧光蛋白的相位滞后。
4．应力的一个完整的周期为为3600。例如，在0.3赫兹，一个完整的周期时间是3.33s。如果CFP落后磁珠0.3秒，将对应的320相位滞后。
均方位移(MSD)：
1．对于CB动力学，应用振动应力(0.3 Hz)。使用单一视图荧光过滤器，获得荧光图像用于MSD的分析。
2．磁珠的时间位移， CFP标记蛋白，YFP的标记蛋白被捕获之前，利用期间和之后的循环应力。
3．通过使用“graythresh”Matlab函数得到珠子的二进制图像，CFP和YFP。然后得到珠子和荧光蛋白的质心坐标。
4．获得每个荧光粒子的坐标，然后用来计算Coilin的MSD和SMN。
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