实验概要
原位PCR技术自上世纪90年代初建立至今，科学家就一直对原位PCR的技术和应用进行研究，目前该项技术已日臻完善。原位PCR既能分辨带有靶序列的细胞又能标出靶序列在细胞内的位置，在分子和细胞水平上研究疾病的发病机理、临床过程以及病理的转归，其特异性和敏感性均高于一般PCR技术。在病毒学、病理学和肿瘤已经成功展示了许多令人瞩目的成就，具有重要的实用价值。
实验原理
原位PCR(In Situ PCR,IS-PCR)是一种把原位杂交的细胞定位技术与PCR的高灵敏度相结合的技术，即通过PCR技术以DNA为起始物，对靶序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增，使其拷贝数增加，然后通过原位杂交方法检测，从而对靶核酸进行定性定量定位分析。随着PCR技术的发展，出现了以mRNA为起始物，通过反转录合成靶序列的cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR扩增，以检测细胞内mRNA靶序列的原位反转录PCR。原位PCR的大致流程主要包括：(1)染色体、细胞及组织切片样品的制备。此阶段中固定很重要，因为并非所有的固定剂都有利于PCR及原位PCR 反应。(2)PCR前处理，包括石蜡切片、去石蜡、染色体变性和细胞穿透，此步既可有利于PCR反应试剂到达靶目标，又可防止扩增后产物漏出，蛋白酶和胰酶是常用的消化膜试剂，不同材料处理的时间和所用酶的浓度有所不同。(3)PCR扩增，一般采用热启动PCR，病毒RNA的扩增需用逆转录PCR。(4)原位杂交及检测。原位PCR按检测方法不同分为：直接原位PCR；间接原位PCR；原位反转录PCR；原位再生式序列复制反应。
实验步骤
对DNA靶序列的PCR扩增主要由高温变性(94℃×1min)、低温退火(55℃
×3min)、适温延伸(72℃×2min)三步组成一轮的热循环重复而成。理论上每次循环PCR产物以2n指数递增，经20～25次循环后，PCR产物的积累可达到最大值，可使靶序列扩增106～7倍。但在实际操作中，每步反应率不可能是100%，因此一般循环次数设定为25～30次。过多的循环次数(>30次)之后酶的催化反应趋于饱和，就会出现“平台效应”。
1. 载玻片用DEPC水洗1min使蛋白酶失活，再用无水乙醇洗1min，室温干燥。此简单步骤即可去除/灭活蛋白酶，不需加热灭活。
2. 取2张切片分别加入：1ul 10×缓冲液(此液由35ul 3mol/L NaAc，1mol/L MgCl2和60ul DEPC水配制而成)，1ul无RNA酶的DNA酶，8ulDEPC水。
3. 用一个灭菌的聚丙烯塑料封条盖住溶液以防止干燥，将载玻片置于一个37℃的湿容器内。
4. 过夜消化，除去封条，用DEPC水洗1min，再用无水乙醇洗，室温干燥。
5. 取一张经DNA酶消化的切片，加入下列溶液：2ul MgCl2(25mmol/L贮存)，
1ul RT缓冲液，1ul dATP、dCTP、dTTP(每种以10mmol/L贮存)，1.5ul DEPC水，0.5ul
3′端引物(20umol/L贮存)，0.5ul RNA酶抑制剂，0.5ul反转录酶。这些试剂在RT-PCR试剂盒中均有。
6. 为了防止干燥，用一小滴指甲油固定住封条，将载玻片放入PCR仪的加热铝板上，盖灭菌矿物油，42℃反应30min。
7. 除去封条，用二甲苯洗5min除去指甲油，再用无水乙醇洗5min，室温干燥。
8. 每一张载玻片加2.5ul PCR缓冲液，4.5ul MgCl2(25mmol/L贮存)，4.0ul
dNTP(每种核苷酸终浓度200umol/L)，1.0ul 2% BSA，0.4ul地高辛标记的dUTP(1mmol/L贮存液),
1.0ul引物1(20umol/L), 1.0ul引物2(20umol/L), 11ul水, 0.5U Taq DNA聚合酶。.
9. 加入上述25ul溶液到载玻片上，盖上封条，用指甲油固定。
10. PCR仪加热至80℃，加入预热的矿物油，终止程序，升温至94℃，运行PCR程序： 94℃ 1min、55℃ 3min、72℃ 2min25个循环。
11. 去除封条和矿物油，用二甲苯洗5min，乙醇5min，室温干燥。
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