间接凝集反应

实验概要

将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关的颗粒载体上，然后与相应的抗体结合，也可出现颗粒载体的凝集现象，称为间接凝集反应。间接凝集反应比直接凝集反应敏感性为高，可用于微量抗体或抗原的检查。本实验介绍了间接凝集反应两种主要方法：间接血球凝集试验、间接凝集抑制试验和协同凝集试验。

实验原理

1. 间接血球凝集试验是根据红血球表面的吸附作用而建立起来的。将细菌可溶性抗原提出使之吸附于红血球表面，此时红血球即称为“致敏红血球”。这种致敏的红血球具有细菌的抗原性，与相应的抗血清相遇可产生凝集现象。

间接血凝抗原的制备可用加碱或加热的方法使菌体中的多糖物质浸出，去除类脂以免干扰红血球的吸附作用。但如系蛋白质时则用来吸附的红血球需先用鞣酸予以处理。

2.  若使可溶性抗原与相应抗体先混合，充分作用后再加入有关的免疫微球，因抗体已被可溶性抗原结合，不再出现免疫微球的被动凝集现象，叫间接凝集抑制试验，临床化验检查中常用的免疫妊娠试验就是一种间接凝集抑制试验。妊娠试验：孕妇尿中绒毛膜促性腺激素的含量比正常尿高。因此当往尿中加入抗绒毛膜促性腺激素抗体时，由于发生抗原抗体反应的结果，抗体被消耗，此时再往尿中加入胶乳抗原(吸附有人类绒毛膜促性腺激素的聚苯乙烯乳胶颗粒)。不发生反应，抗原仍呈乳状液体，即为妊娠试验阳性。反之，被检尿中绒毛膜促性腺激素含量甚少(非妊娠尿)不足以把加入的抗体消耗，当胶乳抗原加入后，抗体便与抗原结合发生反应。出现均匀细小颗粒，妊娠试验为阴性。

3.  金黄色葡萄球菌细胞壁成分中的A蛋白能与人及多种哺乳动物(猪、兔、羊、鼠等)血清中IgG类抗体的Fc段结合。IgG的Fe段与SpA结合后，两个Fab段暴露在葡萄球体表面，仍保持其抗体活性和特异性当其与特异性抗原相遇时，也出现特异凝集现象。在以凝集反应中，金黄色葡萄球菌菌体成了IgG抗体的载体,称为协同凝集反应.本反应也可用于检测微量抗原。

实验步骤

间接血球凝集试验：

材料：

1．抗原—伤寒杆菌O抗原

2．免疫血清：伤寒杆菌O901免疫兔血清

3．25%绵羊红血球悬液，生理盐水，试管吸管等

方法：

1．“O”抗原的制备：

将每毫升100亿的伤寒杆菌“O”菌悬液，置100℃水浴中2小时，离心沉淀吸取上清夜，分装无菌试管，放4℃冰箱备用。

2．致敏红血球悬液制备：

取一定稀释度的抗原加等量2.5%绵羊红血球悬液，混合后放37℃水浴箱中，每隔15分钟取出振摇一次，共经2小时。然后取出，用生理盐水洗涤3次，而配制成0.5%悬液即成。

3．试验步骤：

   1) 小试管9只标好号码于试管架上。

   2) 第1管加入0.9毫升生理盐水，其余各管各加入0.5毫升。

   3) 以吸管吸取已加热灭菌的免疫血清0.1毫升加入第1管，混匀后吸取0.5毫升注入第2管，同样第2管的血清与盐水混匀后吸取0.5毫升注入第3管。如此依次稀释直至第8管。自第8管吸出0.5毫升弃去。第9管不加血清作对照。

   4) 于每管加入0.5毫升已经致敏的0.5%绵羊红血球悬液，混匀后放入37℃水浴中2小时后观察结果。凡最高血清稀释度的免疫血清试管中呈现完全血凝者，即为该血清的间接血清效价。

间接凝集抑制试验：

材料：

1．抗原：吸附有人类绒毛膜促性腺激素的聚苯乙烯抗原

2．抗体：抗人类绒毛膜促性腺激素抗体血清

3．被检材料：孕妇尿

4．正常尿作对照用

5．黑反应板1块

6．滴管3只

方法：

1．用清洁滴管在反应板上滴加一滴被检尿。

2．再往尿滴加抗血清一滴，轻轻摇动，充分混匀。

3．滴加一滴胶乳抗原，缓慢摇动3—5分钟，在较强光线下，观察结果。出现均匀一致的细小颗粒为阴性反应，怀孕。

注意事项：

1．试验材料用具用前使温度接近室温(20℃左右)

2．被检尿太混浊，需要小心过滤。

3．尿中有蛋白及血液时，不宜进行此试验。

协同凝集试验

材料：

1. 抗原:可溶性伤寒杆菌O抗原

2. 免疫血清：伤寒杆菌0901免疫兔血清

3. 10%CoWan1株金黄色葡萄球菌(含大量蛋白A)的菌液

4. PBS0.5%甲醛PBS，吸管、滴管、玻片等

方法：

1．10%葡萄球菌菌悬液的制备：CoWan1株葡萄球菌接种于柯氏瓶，37℃培养18-24小时，用PBS洗下菌苔，每分钟2500转速度离心20分钟。沉淀菌用PBS洗两次后，用0.5%甲醛(用PBS配置)在室温中固定3小时。置于80℃水浴中4分钟以破坏菌体的自源性分解酶。再用PBS洗涤2次后配成10%菌悬液。

2．致敏葡萄球菌：

1毫升10%的菌悬液加0.1毫升伤寒O抗血清充分混合放入37℃水浴中30分钟(中间需摇动两次)。取出后经每分钟2500转速度离心20分钟，弃去上清液，沉淀菌用PBS洗涤2次后配成10%菌悬液。

3．协同凝集试验

   1) 取伤寒“O”可溶性抗原一滴致敏葡萄球菌悬液，一滴在载波片上混匀，观察约2分钟。一般在几秒钟内即可发生凝集。

   2) 滴一滴致敏葡萄球菌悬液于玻片上，用接种环取伤寒O菌培养物少许置于悬液中使成均匀孔状，观察约2分钟，记录有无凝集。

   3) 用伤寒“O”杆菌培养物与未致敏的葡萄球菌菌液或用痢疾杆菌培养物与致敏的葡萄球菌菌液作玻片凝集，均为阴性反应，不出现凝集。