赤霉素对α-淀粉酶的诱导形成

实验概要

赤霉素（gibberellin），是一类属于双萜类化合物的植物激素。赤霉素最突出的生理效应是促进茎的伸长和诱导长日植物在短日条件下抽薹开花。关于赤霉素的作用机理，研究得较深入的是它对去胚大麦种子中淀粉水解的诱发。

种子萌发过程中贮藏物质的动员，需要在一系列酶的催化作用下才能进行。这些酶有的已经存在于干燥种子中，有的需要在种子吸水后重新合成。种子萌发过程中淀粉的分解主要是在淀粉酶的催化下完成的。淀粉酶在植物中存在多种形式，包括α  - 淀粉酶、β - 淀粉酶等。β- 淀粉酶已经存在于干燥种子中，而α - 淀粉酶不存在或很少存在于干燥种子中，需要在种子吸水后重新合成。

实验证明，启动α - 淀粉酶合成的化学信使是赤霉素。萌发的大麦种子的胚产生赤霉素扩散到胚乳的糊粉层中，刺激糊粉层细胞内α -  淀粉酶的合成。合成的淀粉酶进入胚乳，将胚乳内贮藏的淀粉水解成还原糖。因此，没有胚释放赤霉素的活动，α -  淀粉酶就不能合成。外加的赤霉素可以代替胚的释放作用，从而诱导α -  淀粉酶的合成。这个极其专一的反应被用来作为赤霉素的生物鉴定法。在一定范围内，由去胚的吸胀大麦粒所产生的还原糖量，与外加赤霉素浓度的对数成正比。根据淀粉可与  I 2 -KI 显蓝色，而淀粉分解的产物还原糖不能与 I 2 -KI 显色的原理，可以定性和定量地分析α - 淀粉酶的活性。

主要试剂

1%次氯酸钠溶液；

0.1%淀粉溶液：淀粉1g，KH₂PO₄ 8.16g定容至1000mL；

2×10^–5mol/L赤霉素溶液：6.8mg赤霉素溶于少量95%乙醇，加水定容至1000mL；
10^–3mol/L 醋酸缓冲液；

I₂-KI溶液：0.6gKI、0.06g I₂溶于1000mL0.05mol/L HCl中。

主要设备

分光光度计、恒温箱、水浴锅、移液管、烧杯、试管、青霉素小瓶、镊子、刀片。

实验材料

大麦、小麦种子

实验步骤

1. 选取大小一致、健康的大麦种子50粒，用刀片将每粒种子横切成两半，使成无胚的半粒和有胚的半粒，分别置于新配制的1％次氯酸钠溶液中，消毒15min，取出用无菌水冲洗数次，备用。

2. 取小瓶6只编好号码，按表加入各种溶液和材料，于25℃下培养24小时（最好进行振荡培养，如无条件，则必须经常摇动小瓶）。

3. 淀粉酶活性分析：从每个小瓶中吸取培养液0.1mL，分别置于事先盛有1.9mL淀粉磷酸盐的溶液中，摇匀，在30℃温箱或水浴中精确保温10min，然后加I₂-KI溶液2mL，蒸馏水5mL，充分摇匀，于波长580nm下测定吸光度，以蒸馏水为空白校正仪器零点。读数，从标准曲线查得淀粉含量，以被分解的淀粉量作为淀粉酶的活性。

4. 以不同淀粉浓度（0～700μg/L）或淀粉量（0～1000μg）及其吸光度绘制标准曲线。

5. 计算

   1) 1瓶为淀粉的原始量（X）。

   2) 2～6瓶分别为反应后淀粉的剩余量（Y）。

   3) 粉水解量=[（X—Y）/X]×100%。