噬菌体抗体库的富集筛选

实验概要

用于噬菌体抗体库富集筛选的抗原至关重要，一般来说，纯化后的可溶性蛋白纯度高，含量大，可直接包被ELISA板，是筛选特异性抗体的最佳选择。在某种情况下，需要获得针对某一特殊蛋白的单克隆抗体，也可以用抗这种蛋白的单克隆抗体捕捉抗原的方法来进行筛选。

实验步骤

1. 将用于筛选特异性抗体的抗原用0.1mol/L pH值8.6碳酸钠碳酸氢钠溶液做一定量稀释后包被96孔板，一般抗原浓度要求至少25μg/ml，每孔50~60μl，4℃过夜。

2. 次日洗去板中未吸附的抗原，用3% BSAPBS或用4%~5%脱脂奶粉PBS于37℃封闭1h 。

3. 弃封闭液，在每孔加入50~70μl噬菌体抗体库，37℃孵育2h。

4. 弃孔中未结合噬菌体，用TBS/Tween 20(pH值7.5的50mmol/L TrisHCl，150mmol/L氯化钠，0.5% Tween 20)洗液洗每一孔，共洗10~20次，充分洗去非特异性吸附噬菌体。每一次清洗时，可用带有吸头的移液器反复吹打每孔，但是切勿过度。

5. 用蒸馏水洗两次，将每孔中的液体吸干净。

6. 每孔加入pH值2.2的甘氨酸盐酸洗脱缓冲液50μl，室温孵育10min，期间用移液器吸头反复吹打几次，但注意勿吹出过多气泡。

7. 加入3~5μl 2mol/L Tris，使溶液的pH值在7.0左右，以中和洗脱下来的噬菌体溶液。

8. 立即加入2ml新鲜制备的OD₆₀₀=1左右的Ecoli XLIBlu菌，室温孵育15~20min。

9. 转入一200ml三角瓶中，加入10ml SBA T (SB培养基，20μg/ml氨苄青霉素，10μg/ml四环素)立即取10μl、1μl和01μl涂LB氨苄平皿以滴定洗脱下来的噬菌体，其余部分转入三角瓶，于37℃振荡培养1h。

10. 加入100ml SBA T (SB培养基，50~100μg/ml氨苄青霉素，10μg/ml四环素)，37℃ 1h。

11. 加入1012pfu的辅助噬菌体VCSM13，37℃ 2h。

12. 加入卡那霉素70μg/ml，37℃振荡培养过夜。

13. 重复以上富积筛选步骤，至少如此重复三轮至四轮。

14. 经三轮富集筛选后，将洗脱下来的噬菌体感染新鲜制备的XLIBlu菌，37℃过夜培养后，保存长有单个菌落的平皿于4℃待用。