实验概要

本实验介绍了微量快速平板法抗补体试验的操作流程。

主要试剂

抗凝保存液中保存的绵羊红细胞、马抗绵羊红细胞抗血清(溶血素)、pH值7.4巴比妥缓冲液、聚合IgG、0.04%氨溶液。

主要设备

12×8孔的U型微量板、稀释器(50μl)、分液器、离心机(MSE 6 L，可使U型微量板离心)、72型分光光度计等。

实验步骤

1. 致敏绵羊红细胞的制备

   1) 将5ml抗凝保存液中的红细胞2 500 r/min离心5min；

   2) 弃去上清液，沉淀细胞用pH值7.4巴比妥缓冲液应用液洗涤3次，每次3 500 r/min离心5min；

   3) 吸取0.9ml洗涤过的压积红细胞加入上述缓冲液配成6%红细胞悬液；

   4) 为了使红细胞标准化，取0.2ml稀释的红细胞悬液加入4.8ml 0.04%氨溶液，在72型分光光度计(波长541nm，比色杯为1cm)，以蒸馏水作空白，读数；

   5) 根据以下公式调整6%红细胞悬液的体积(V)：

   V体积(ml)=15×光密度0.49

   V-15=还需加入6%红细胞悬液中的缓冲液毫升数。

   6) 于上述1.5ml 6%红细胞悬液中加入1.5ml 1∶150稀释的溶血素，充分混匀后，37℃水浴15～20min，此种3%致敏绵羊红细胞，可于4℃保存过夜，使用前，再经37℃水浴保温。

2. 豚鼠补体的滴定

   1) 于冷冻干燥的豚鼠补体中，加蒸馏水至原来体积，室温放置5min，轻轻混匀，避免产生气泡；

   2) 将上述豚鼠补体用pH值7.4巴比妥缓冲液应用液作1∶10稀释，轻轻混和，避免产生气泡；

   3) 将1∶10豚鼠补体作进一步稀释，充分混匀，避免产生气泡；

   4) 用分液器从每个补体稀释度中取50μl移至U型微量板的一行相应孔中(每行8孔)，第8孔加入50μl、pH值7.4巴比妥缓冲液应用液作对照。具体操作时先加入缓冲液对照，然后从最高稀释度开始按顺序加入不同稀释度的补体；

   5) 在U型微量板各孔中加入100μl、pH值7.4巴比妥缓冲液应用液及50μl致敏绵羊红细胞；

   6) 在微量板上放置一块玻璃板，周围用胶布密封，以避免液体蒸发，37℃温箱内放置1h，每20min混匀一次；

   7) 于室温再放置3～4h，使红细胞自然沉降，或用MSE 6 L离心机2000 r/min离心5min；

   8) 观察结果，对照孔应不溶血，在一般情况下，1∶40补体稀释孔应完全溶血。以恰好能使致敏红细胞完全溶血的最高补体稀释度作为补体滴度，称为最小溶血量(MHD)，补体滴度通常为1∶60～1∶80，偶而可达1∶130。

3. 抗补体活性测定

   1) 在U型微量板上按序号，每份被检标本一行(12孔)，另一行作为对照，分别加入50μl pH值7.4巴比妥缓冲液应用液；

   2) 第1孔加入50μl被检标本，用稀释器将标本依次作倍比稀释，从1∶2～1∶4.096。从最后1孔中弃去50μl。另将聚合IgG 50μl加于对照行的第一孔中，同法作倍比稀释；

   3) 每孔中加50μl pH值7.4巴比妥缓冲液应用液；

   4) 每孔中再加入2MHD豚鼠补体(如1MHD=1∶80，2MHD=1∶40)；

   5) 在微量板上放一块玻璃板，周围用胶布密封，4℃放置16～18h；

   6) 加入50μl致敏绵羊红细胞，再用胶布密封；

   7) 37℃保温1h，每20min混匀一次；

   8) 室温再放置2～5h或用MSE 6 L离心机2000 r/min离心5min；

   9) 根据孔底沉降红细胞状况，按以下五级标准记录结果：

   0级：完全溶血，无红细胞；

   1级：大约溶解75%红细胞；

   2级：大约溶解50%红细胞；

   3级：大约溶解25%红细胞；

   4级：无溶血。