实验概要
本实验介绍了辣根过氧化物酶标记试剂对三种底物的使用方法。辣根过氧化物酶标记试剂底物范围较广，包括二氨基联苯胺(DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑(AEC)等。
实验原理
1. DAB是辣根过氧化物酶最敏感、常用的底物。它产生强烈的棕色产物，在水和醇中不溶解。多数情况下，推荐在DAB中加入不同的金属离子。当加入金属盐如钴、镍至底物液中，辣根过氧化物酶可以更加敏感。此类反应产物呈暗蓝灰色至黑色，且在水及醇中稳定。DAB／金属盐染色应用的组织染色范围较广。
2. 氯萘酚可以形成一种蓝黑色产物。敏感性低于DAB，且产物可溶于醇中。它适用于当DAB反应形成较高背景或要求改变产物的颜色。
3. AEC产生红色产物，其敏感性低于DAB，但可用于DAB反应产生较高背景或要求改变产物颜色的试验。此产物可溶于醇，但不溶于水。
主要试剂
1. DAB需要的溶液
DAB，0.05mol／LTris缓冲液(pH7.6)；
0.3％(W／V)氯化镍／水贮存液；
30％过氧化氢；
DPX。
2. 氯萘酚需要的溶液
0.03％氯萘酚，用无水乙醇溶解(贮存在-20℃)，0.05mol／LTris(pH7.6)
过氧化氢；
Gelvatol或者Mowiol。
3. AEC需要的溶液
0.4％AEC用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解；
0.1mol／L乙酸钠缓冲液(pH5.2)；
过氧化氢；
Gelvatol或Mowio1。
主要设备
光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果)。
实验步骤
1．DAB操作步骤
1) 用9ml 0.05mol／LTris缓冲液(pH7.6)溶解6mgDAB；
2) 加lml0.3％(W／V)氯化镍／水贮存液(也可以用等量的氯化钴替代)；
3) 加0.1 m1 3％过氧化氢。过氧化氢一般以30％的溶液提供，贮存在4℃，此条件可以持续1个月；
4) 如果出现沉淀，用滤纸过滤；
5) 加此溶液至标本，并孵育1-20min水洗终止反应；
6) 优化：如果需要可复染；
7) 用DPX封片。
2．氯萘酚操作步骤
1) 氯萘酚贮存液的准备：用10ml无水乙醇溶解0.3g氯萘酚，贮存于-20℃；
2) 加100ul氯萘酚贮存液至10ml 0.05mol／LTris(pH7.6)，
3) 加0.1ml 3％过氧化氢于水中。过氧化氢一般是以30％的溶液提供，4℃可存放1个月；
4) 白色沉淀可用滤纸过滤去除；
5) 加此溶液到标本中，并在室温孵育10～40min，水洗终止反应；
6) 优化：如果需要，进行复染，但只可使用水溶性染料；
7) 用Gelvatol或者Mowiol封片。
3．AEC操作步骤
1) 用lmlDMF溶解4mgAEC。AEC在DMF中稳定，因此，可以用100mlDMF溶解0.4gAEC作为贮存液备用；
2) 加lmlAEC溶液至15ml 0.1mol／L的乙酸钠缓冲液(pH5.2)中，并搅拌；
3) 加0.15ml 3％过氧化氢于水中。过氧化氢一般是30％的溶液提供，在4℃可存放1个月；
4) 用滤纸过滤；
5) 加此溶液到标本中，并于室温孵育10～40min，水洗终止反应；
6) 优化：如果需要复染，只可用水溶性染料；
7) 用Gelvatol或Mowiol封片。
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