碱性磷酸酶标记试剂的使用

实验概要

本实验介绍了碱性磷酸酶标记试剂的使用方法。BCIP／NBT是碱性磷酸酶最常使用的呈色底物，碱性磷酸酶标记的试剂应该用真核生物的碱性磷酸酶，因为这种酶容易被EDTA灭活。细菌酶难以终止其活性，易引起显色过度，导致较高背景。

BCIP／NBT底物在酶结合位点形成强烈的黑紫色沉淀，此反应是一个稳定进行的过程。因此，可设定一个精确的反应对照。可以通过孵育时间的长短控制反应的敏感性。

主要试剂

碱性磷酸酶缓冲液：100mmol／L NaCl，5mmol／L MgCl₂，100mmol／L Tris(pH9.5)；

NBT溶液(0.5gNBT用10ml 70％DMF溶解，贮存在4℃)；

BCIP溶液(0.5gBCIP[二钠盐]用10ml100％DMF溶解，贮存在4℃)；

20mmol／LEDTA用PBS溶解，DPX。

主要设备

光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果)

实验步骤

1. 细胞染色前，准备3种贮存液：

   1) NBT：用10ml 70％DMF溶解0.5gNBT；

   2) BCIP：用10ml 100％DMF溶解0.5g BCIP[二钠盐]；

   3) 碱性磷酸酶缓冲液：100mmol／LNaCl，5mmol／LMgCl₂，100mmol／LTris(pH 9.5)。所有的贮存液置4℃可保存1年。

2. 实验前，底物液新鲜配制。加66ul NBT贮存液至10ml碱性磷酸酶缓冲液中，充分混合，加33ul BCIP贮存液，在1h内使用。

3. 将洗涤过的标本片放在一个适当的容器内。加足够量的底物液覆盖标本片(3～5ml适合于100mm平皿)。在室温中进行反应直到染色达到适当黑色。对一些试剂可在显微镜下定期监测。一般孵育时间大约是30min。

4. 在含有20mmol／LEDTA的PBS中漂洗以终止反应，螯合Mg² 。

5. 优化：如果需要，进行复染。

6. 用水冲洗，DPX封片。