实验概要
本研究通过分析三种蚜虫mtDNA COI/COII基因序列的进化，揭示了三种蚜虫与已知其它蚜虫的该段序列的进化关系。
实验材料
本研究中的蚜虫为桃蚜、豆蚜、棉蚜。桃蚜、豆蚜、棉蚜在实验室内分别用萝卜、菜豆、黄瓜进行饲养；各种群分别置于50X50X50的正方体铁架外罩100目双层沙网内，饲养条件为20-22℃相对湿度60-70%。
实验步骤
1. 蚜虫总DNA的提取
1) 向事先已编号的1.5mL离心管内分别加入20ulSTE缓冲液(100mmol/LNaCl，10mmol/L Tris-HCl，lmmol/L EDTA，pH 8.0 )，然后分别将离心管置于冰上；
2) 挑取新鲜单头成蚜虫放入离心管内，立即用塑料碾槌碾磨；
3) 碾磨后将离心管置于冰上，重新取下一头成蚜虫放入另一个离心管内，重复第二步；
4) 分别向离心管内加入1.6ul蛋白酶K (10mg/mL )；
5) 简单离心后，37℃下孵育30min；
6) 95℃初始变性5min；
7) 简单离心后，-20℃保存或用2ul作为PCR反应的模板，立即进行PCR扩增。
使用一对特异性引物扩增蚜虫mtDNA-COI/COII基因。
上游引物为：5’-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG -3'；
下游引物为：5’-CCACAAATTTCTGAACATTGACCA -3'
每50ul扩增反应体系含：2uL DNA模板，30.6uL ddH2O，5ul l0Xbuffer，5ul MgCl2(25 mmol/L)，4uL dNTPs(10mmol/L each )，0.4ul Taq DNA聚合酶，上游和下游引物各1. 5ul( 20 umol/L each )。
PCR反应条件为：94℃预变性2min；然后94℃30s，55℃30s，72℃45s，5个循环；接着94℃30s，54℃30s，72℃45s，5个循环；94℃30s，53℃30s，72℃45s，5个循环；94℃30s，52℃30s，72℃4Ss，5个循环；94℃30s，51℃30s，72℃45s，5个循环；94℃3.0 s，50℃30 s，72℃45s，4个循环；94℃30s，49℃30s，72℃45s，3个循环。上述扩增至少重复两次，以确保结果的可靠。
扩增产物的检测：取PCR反应产物5-9ul，在1.0% (g/mL)的琼脂糖凝胶上60V电压电泳30min，最后在Gel Doc EQ凝胶成像系统(Bio-Rad，Hercules，CA)下观察。
2. PCR产物纯化
利用Tiangen Biotech (Beijing)公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，步骤如下：
1) 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量；
2) 向胶块中加入3倍体积溶胶液，50℃水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解，如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块完全溶解；
3) 将上一步所得溶液加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，13000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；
4) 向吸附柱中加入700ul漂洗液，13000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；
5) 向吸附柱中加入500ul漂洗液，13000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中，13 000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步实验；
6) 将吸附柱放入一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量65-70℃水浴预热的洗脱缓冲液，室温放置2分钟，13000rpm离心1分钟收集DNA溶液。
3. 连接和转化反应
将纯化产物连接至pGEM-T载体(Promega，USA )，并进一步转化到感受态大肠杆菌DH5α中，具体操作步骤如下。
1) 连接反应
a. 短暂离心装有载体的离心管，以免液体挂在管壁上；
b. 将反应体系加入200ul的离心管，10ul反应体系具体加量如下：2xRapid Ligation Buffer 5ul，pGEM-T载体lul，PCR产物3ul，T4 DNA Ligase 1ul；
c. 用枪头吸打混匀反应体系，4℃放置过夜反应。
2) 转化反应
a. 从-70℃冰箱中取出感受态细胞DH5α，冰上放置10min解冻，轻弹管壁以混匀细胞；
b. 短暂离心连接反应管，取全量或一半体积的连接反应物于解冻后的感受态细胞中轻弹混匀，冰水浴40min，中间摇一次，防止菌体沉淀；
c. 取出离心管，于42℃水浴90sec热休克；
d. 冰浴2min；
e. 离心管中加入900ul LB培养液(AMP-)(无菌操作)；
f. 37℃温和地振摇2h，使细菌复苏；
g. 4000rpm常温10min离心，倒去上清，保留150ul左右，吹吸使菌体重溶，往菌液中加入3.5ul 200mg/mL IPTG和60ul 20 mg/mL X-Gal混匀，将混合液体涂于预先处理好的带有Amp 的平板培养基上，待吸收后倒置放入37℃烘箱中，培养12-16h，观察蓝白菌落；
h. 取灭菌的10 mL试管若干，加入约3 mL左右的LB培养液(Amp ) ；
i. 用灭菌牙签小心挑取白色菌落，置于试管中；
j. 37℃，250rpm/min振荡培养过夜，至溶液混浊；
k. 将经过培养后的菌体直接进行PCR检测。
4. 序列测定
经PCR检测后将阳性克隆用于测序。所有测序工作均由大连TaKaRa公司完成，选用377测序仪。每个地理种群随机抽取3个样本进行测序，以它们的一致序列为准。
5. 序列分析
获得的DNA序列先提交到GenBank数据库中，然后利用“BLAST”，工具(NCBI站点)进行序列分析、DNA序列检索；用GenDoc软件进行序列同源性比较；用BioEdit软件进行序列编辑；用Clustal X软件(Thompson等，1997)进行序列比对(alignment )；比对结果输入MEGA2.1软件(Kumar等，2001)，采用距离法计算各样品间的遗传距离，并基于Kimura-2 Parameter模型，用邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统发育树，通过自展1000次检验获得系统树分支的置信度。
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