实验概要
本实验中运用Perl脚本用于比较Nipponbare和93-11基因组序列，从而开发潜在的ILP标记，通过EPIC-PCR开发候选ILP标记，最后用实验验证及评价了ILP标记。
实验步骤
1. 水稻釉粳亚种基因组比较搜索ILP
我们运用Perl脚本用于比较Nipponbare和93-11基因组序列，从而开发潜在的ILP标记。首先运用BLASTN程序比较水稻cDNA序列和Nipponbare和93-11基因组序列，获得可能的cDNA所在的位置。我们使用BLASTN(参数为value=10-20)处理去除旁系同源基因。然后，SIM4程序比对cDNA和它相应的Nipponbare BAC克隆以及93-11 Scaffold，从而找出基因的结构(内含子的剪接位点及内含子与外显子的数目)和这两个亚种相应基因上ILPs。我们仅对两个亚种间表现出相同结构(剪切位点相同位置具有相同数目的内含子)的基因作为等位基因，从而提高开发共显性的ILP标记的可能性。
2. 通过EPIC-PCR开发候选ILP标记
为了从潜在的ILP中开发ILP标记，我们用Prime3(http://www.hgmp.mrc.ac.uk)在Nipponbare的cDNA序列相应的两侧外显子上设计PCR引物。为了方便，我们用了200bp的cDNA序列，即每个ILP的两侧引物的长度为100bp。经模拟分析，发现这种cDNA的长度能够保证设计引物有93%的成功率。之后，我们分别用Nipponbare和93-11的基因组序列进行电子PCR(e-PCR)测试设计的引物。为了提高开发的ILP标记的质量和可用性，我们要求引物和模版精确匹配。当用e-PCR成功扩增，并且条带唯一，我们就得到一个潜在的ILP标记转为候选ILP标记，并且用简称RI(Rice ILP)跟一个不重复的编号(如RI03 281)来命名。
3. 实验验证及评价ILP标记
我们选取了215个候选ILP标记进行实验评估。根据RGP的水稻遗传图，选取的候选ILP标记大致以平均8 cM的距离均匀分布在水稻的基因组上。我们所选的大多数候选ILP标记直接使用两侧外显子上设计PCR引物，我们还为产物较大而差异较小的内含子重新设计引物，从而可通过电泳检测其多态性。所有的引物均由上海Sangon生物工程技术公司或上海BioAsia生物技术公司合成。
我们用Nipponbare, 93-11及其它们的F1代进行分析。采用改进的CTAB方法从嫩叶中萃取染色体组的DNAs。我们做PCR实验用15 ul的反应混合体系，包括50ng的DNA模板，两种引物各0.5 uM，每种dNTP各200 aM, 1.5mM的MgCl2, 0.1%的Triton X-100和1U的Taq聚合酶，1.5ul的10 X PCR的缓冲液。我们首先用Td-PCR程序测试了所有的引物对:94度, 5分钟;94度30秒10个循环，每循环控制在59度-0.3度30秒，72度1分钟，94度30秒20个循环，56度30秒，72度1分钟，最后的延伸72度5分钟。对于没有产生理想扩增效果的引物对，我们将最初的退火温度(59度)调整为60度或57度。使用Td-PCR的目的是增加扩增的特异性，但是一些引物对只要求常规PCR程序:94度5分钟;94度30秒35个循环，54度30秒，72度一分钟，最后的扩增72度5分钟。对于大多数的引物，我们用6%的非变性PAGE(250V. 2h)分离PCR产物并银色着色。
对于成功获得PCR产物的引物，我们用10个水稻品种包括Nipponbare和93-11在内的进一步做了测试，这些水稻品种由中国水稻研究所(CNRRI)提供。基于PCR所得的数据，我们求出了每个ILP标记的等位基因的差异值，使用的方法是多态性信息评价(PIC)来定义
，这里Pij是指第i个标记出现第j种带型的频率。
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