实验概要
本实验介绍了谷胱甘肽琼脂糖凝胶的使用方法。Pgex载体表达的外源蛋白与谷胱甘肽S-转移酶溶合，因此可以通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。Pgex是一类以谷胱甘肽(γ-谷胱甘肽半胱胺酰甘氨酸)作为底物，通过形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。由于GST对底物的亲和力是亚豪摩尔级的，因此谷胱甘肽固化琼脂糖形成的亲和层析树脂GST及其融合蛋白的纯化效率很高。可以用含游离谷胱甘肽的缓冲液洗脱结合GST融合蛋白。树脂用3mol/L NaCl的缓冲液再生。谷胱甘肽琼脂糖对GST融合蛋白的结合能力很强(每毫升柱床体积的树脂能结合8毫克融合蛋白)。
主要试剂
谷胱甘肽洗脱缓冲液：10mmol/L还原型谷胱甘肽，50mmol/L Tris-Cl(PH8.0)
实验步骤
谷胱甘肽树脂的处理：
1. 轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆；
2. 取部分匀浆放入15ml聚丙烯管(每100ml 细菌培养物需要2ml匀浆)；
3. 4℃ 500 g离心5分钟，小心去掉上清；
4. 在树脂中加入10倍柱床体积的冷的PBS，颠倒数次，混合均匀，4℃ 500 g离心5分钟，小心去掉上清；
5. 每毫升树脂加入1毫升冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒数次，混合均匀，悬液冰上放置待用；
制备细胞抽提物：
6. 每100毫升培养基的细胞沉淀悬于4mlPBS；
7. 加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰上放置30分钟；
8. 用针筒将10ml 0.2%TritonX-100
强行注入黏的细胞裂解物中，剧烈振动数次均匀。加入DNase和RNase至终浓度5ug/ml，4℃振动温育10分钟，4℃3000g离心30分钟，去除不溶性细胞碎片，上清转移到一只新管中，加入DTT至终浓度1mmol/L；
纯化融合蛋白：
9. 细胞裂解物与适量50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，每100毫升细菌培养物加2ml树脂，于室温轻摇30min；
10. 混合物于4℃以500g离心5分钟，小心去掉上清并留样少许进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；
11. 沉淀中加入10倍柱床体积的冷的PBS，颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白；
12. 4℃以500g离心5分钟，小心去掉上清并留样少许进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；
13. 重复步骤11和12两次；
14. 合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱，也可用凝血酶、肠激酶或Xa因子切割；
1) 用谷胱甘肽洗脱融合蛋白
a. 沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min,洗脱树脂上结合的蛋白；
b. 如步骤12离心，上清(含洗脱的融合蛋白)移至管中；
c. 重复步骤a和b，合并三次上清。
2) 蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上挥手靶蛋白
a. 在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶、肠激酶或Xa因子(根据融合蛋白中的位点选择)，每ml树脂加入50单位溶于1mlPBS的蛋白酶。颠倒离心管数次混匀，室温下振荡2-16小时。用小规模试验确定精确时间。
b. 4℃以500g离心5分钟，上清小心移至新管中。(GST仍结合在树脂上，而靶蛋白也在上清中，仍需要奋力)。
15. 10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析每一步样品的蛋白质组成。
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