实验概要

先前的研究表明，DC衍生的外质体与Tag共孵育后可在同源和异源小鼠上诱导抗鼠弓形虫保护性免疫应答。免疫保护与诱导了体液和细胞特异性TAg反应有关。

本研究中，我们评估了在怀孕的小鼠上DC衍生的外质体是否能诱导保护性免疫应答，并在实验模型中是否能预防小鼠先天性弓形体病。

实验材料

1. 动物

   6-10周的CBA/J小鼠

2. 寄生虫

   鼠弓形虫 RH株速殖子 76K株囊肿

实验步骤

1. 弓形虫属超声处理的准备

清洗速殖子，超声处理，离心。最后一次离心的上清液作为抗原的来源。蛋白浓度用蛋白试剂盒检测，以牛血清蛋白(BSA)作为标准。等分装好存于-80度备用。

2. DC细胞系和外质体分离

SRDC DC系

SRDC是脾细胞DC系，形态、表型和活性与那些从活体纯化来的CD8a CD205 CD11b- DCs相似。SRDCs培养与完全培养基。SRDC衍生的外质体的制备通过对SRDC上清液的各种不同的离心法。外质体的蛋白浓度用试剂盒检测。

3. 抗原与DCs共培养

SRDCs在含有TAg的完全培养基中孵育12h。然后彻底清洗，计数，用与免疫。

4. 小鼠接种疫苗

雌性小鼠脾下注射100万TAg共孵育的SRDCs或100万SRDCs，或10ug TAg共孵育的外质体或未孵育的外质体，对照组有：未免疫未感染、未免疫感染，注射10ug TAg.

5. 评估抗先天性弓形虫病的保护性

二次免疫后2星期，每组被分为两个亚组，第一组用于评估对先天性弓形体病的保护效应，第二组用于评估慢性弓形体病的保护效应。第一组未交配过的雌性老鼠注射疫苗，并与雄性老鼠交配，在怀孕期第13天接种25个囊肿。分析胎儿的存活率和检测体重。42天后眼球采血，血样存于-20度，用于检测体液反应。杀死小鼠，分析细胞反应，分析脾细胞和肠系膜淋巴结T细胞的增殖，细胞因子产量，脑组织囊肿数。

6. 体液反应

用ELISA滴定血样中特异性抗原IgG、IgG-1、IgG-2a、IgG-2b和抗体IgG-3。抗原特异性抗体滴度检测，最高稀释度的倒数，在同样稀释度下比对照组高2倍的吸光度。结果用对数表达。肠分泌物中分泌型IgA(IgAs)用免疫印迹法检测，感染小鼠的血清和肠分泌物和1E5  mAb 作为阳性对照。

7. 抗原刺激细胞增殖反应

出生后6周，在无菌条件下，采集脾和肠系膜淋巴结。脾和淋巴结通过血液尼龙过滤网挤压除去组织碎片并产生单个细胞悬浮。低渗休克法除去脾红细胞。细胞悬浮于RPMI-1640(加了FCS、HEPES、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠……)。细胞接在96孔的平板中，每孔50万细胞和200uL培养基，或加5ug  TAg 或加10ug的伴刀豆素蛋白A作为增殖的阳性对照。37度，5%CO₂孵育3天，最后18h时加入1uCi [³H] thymidine。玻璃纤维过滤器收获细胞，合并入增殖细胞DNA的[³H] thymidine用LSC检测。增殖指数用刺激指数表达。

8. 细胞因子含量测定

用TAg刺激过的脾脏和肠淋巴结释放的细胞因子的检测，在培养基的上清液收集IL-5和IL-4(24h)，IL-2(48h)，IFN-γ(96h)。用ELISA试剂盒检测。

9. 脑中的囊肿

6周后杀鼠，怀孕的和雌性的小鼠在攻虫2个月后杀死，取脑。每个脑加5 ml RPMI后研碎，在显微镜下计数囊肿。