IL-2质粒DNA探针制备的操作步骤

实验概要

本实验介绍了IL-2质粒DNA探针制备的详细步骤。

实验步骤

1. 含IL-2质粒DNA探针的提取

   1) 取含IL-2质粒DNA的单个菌落置两个25ml LB培养基(含100μg/ml Amp)，37℃ 220r/min 振摇过液(约16h )；

   2) 取10ml菌液加200ml LB培养液(含100μg/ml Amp)，37℃ 150r/min振摇 4h；

   3) 加氯霉素(终浓度170μg/ml)，37℃ 220r/min振摇3h；

   4) 菌液倒入300ml离心管中离心，4℃ 5000r/min×10min离心弃上清除去残液(吸水纸无菌)；

   5) 每管加40ml STE溶液(冰预冷)悬浮细菌后，用移液管转入到50ml离心管中，4℃ 5000r×15min离心；

   6) 弃上清，加5ml溶液1(冰预冷)悬浮细菌，加1 ml新配制(pH8.0)的溶菌酶(10g/ml)，轻摇，室温静置5min；

   7) 加10ml溶液II，盖上盖子，将离心管小心颠倒数次混合液体，不要用旋涡振荡器，冰浴10min，且勿摇动；

   8) 加7.5ml溶液III(冰预冷)摇振荡离心管数次使之混合，冰浴20-30min，使沉淀完全，4℃ 12000r/min×20min离心；

   9) 取上清到另一50ml离心管中，加0.6体积异丙醇，混匀、室温静置15min，室温5000r/min×15min离心弃上清；

   10) 用75%乙醇洗涤沉淀一次(不将沉淀悬浮)，将乙醇倒置吸水纸上，使乙醇挥发；

   11) 用1.5m1TE(pH8.0)将沉淀溶解加等体积冰预冷的5MLiCl，混匀后置冰溶10min，4℃12000r/min×10min离心；

   12) 取上清至新EP管，加等体积的异丙醇(约3ml)充分混合、室温静置15min，室温12000rmin×10min离心(回收沉淀的核酸)；

   13) 小心去上清，将管倒置以使最后残留的液滴流尽，用75%乙醇洗涤沉淀，流尽乙醇，用吸低吸去附于管壁的液滴，将管倒置在纸巾上数分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发；

   14) 加入RNA酶(终浓度100μg/ml)用500u1TE溶解沉淀DNA，移至新EP管中，37℃水浴30min；

   15) 加等体积(500ul)含13%(W/V)PEG(800)的1.6mol/L NaCl，充分混合，4℃ 12000r/min×5min离心；

   16) 吸去上清用400u1TE(PH8.0)溶解质粒DNA沉淀；

   17) 加等体积饱和酚(400ul)混合，12000r/min×10min离心；

   18) 吸上层水相移至另一EP管加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)剧烈混匀至乳白状，12000r/min×10min离心；

   19) 吸上层水相移至另一EP管，加等体积氯仿：异戊醇(24:1)混匀，12000r/min×10min离心；

   20) 吸上层水相移至新EP管(硅化)、加入0.1体积的3mol/L NaAC(pH5.2)和2体积的-20℃，预冷的无水乙醇、混匀(可见沉淀出现)，置-20℃2h或0℃20min，4℃12000r/min×15min离心；

   21) 弃上清，加75%乙醇(4℃预冷)200u1，稍加振荡，离心洗涤2次，4℃12000r/min×5min离心去上清；

   22) 敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量与乙醇挥发，溶沉淀于11μlTE溶液中；

   23) 取1μl电泳其余进行酶切。

2. 经0.7%琼脂凝胶电泳，确定有质粒DNA后，用XhoI进行酶切。

酶切反应体系：10μl质粒DNA，6μl内切酶XhoI，6μl 10 X酶切缓冲液，38μl蒸馏水，总体积为60μl；37℃消化过液。

3. IL-2 DNA片段的回收和纯化

可以使用任何一种回收与纯化DNA片段的方法，下面介绍的是用Wizard^TNPCR纯化试剂盒回收IL-2 DNA片段。

   1) 将60μl酶切反应体系经1%琼脂糖凝胶电泳；

   2) 紫外灯下切下IL-2 DNA片段，挑出凝胶到EP管中，加1 ml Resin，使凝胶深化；

   3) 用5ml一次性注射器将Resin/DNAmix转移到Wizard Minicolumn中，

   4) 用2ml80%异丙醇洗涤Minicolum；

   5) 12000g离心20min；

   6) 将Minicolumn转移至新EP管中，加50ul灭菌双蒸水到Minicolumn中，12000g离心20S，收集DNA。