实验概要
从海马体中分离到神经元细胞,然后进行培养细胞以便进行其他的实验研究。
主要试剂
解剖液
MEM
HBSS
主要设备
L-多聚赖氨酸包被的平皿或盖玻片
实验材料
出生24h内的乳鼠
实验步骤
1. 用冷却的解剖液(0℃,最高2-3℃)冲洗海马两次。
2. 在冷却解剖液(2-3℃)中解剖无脑膜的海马。
3. 加入胰蛋白酶(调整终浓度为0.25%),在15毫升Falcon管中37°处理15分钟。一般10至20个海马用溶液5毫升。
4. HBSS或MEM溶液洗两次,停止消化。
5. 用1至3毫升含10%胎牛血清的MEM溶液重悬。
6. 用1000mL的微量移液器吹打混匀(10次左右)。
7. 等待1-2分钟,待未消化的海马组织沉至底部后,吸取已消化的细胞转移到新的管中。向未消化的组织中加入2毫升的HBSS,并通过巴斯德管的处理直到组织完全分离,并将消化的细胞转至同一管中。
8. 计数细胞的数量。
9. 用培养基将神经元细胞稀释到所需浓度。将细胞移至多聚赖氨酸处理过的平皿或盖玻片上。并依照平皿或盖玻片的大小优化细胞数量。例如,2mL密度为300 000-400 000每毫升的细胞液,可以培养在35毫米平皿上。
10. 在没有胶质细胞饲养层的情况下,细胞在37℃,5%二氧化碳和含10% Nu-血清的组织培养基中培养。
注意事项
1. L-多聚赖氨酸(0.1mg/ml)包被培养板后,因为对神经元有毒性,要待其干后才能接种。可以回收再利用。
2. 取脑组织时动作要尽量快,保持低温操作。
3. 分离皮层和海马时,尽量少残余血管和脑膜,否则会培养大量的成纤维细胞。
4. 接种细胞后24h内勿移动,以防影响贴壁。