大蒜GSH和NPT的测定

实验概要

本实验以大蒜幼苗为试材，对根和叶的总谷胱甘肽(GSH)含量和非蛋白巯基(NPT)含量进行了测定。

主要试剂

Na₃AsO₄，CdCl₂，CuSO₄，NaCl，5%的磺基水杨酸(ssA)溶液，磷酸盐缓冲液(1.8 mM DTNB，0.3 mM KH₂PO₄/K₂HPO₄，15mM Na₂EDTA，PH=7.8)

主要设备

支持架，低温冰箱，水浴锅，研钵，紫外-可见分光光度计(Ultrospec型，Pharmacia Biotech公司)，高效液相色谱仪，Millionium软件

实验材料

蒜瓣

实验步骤

1. 样品准备

将蒜瓣置于特制支持架上，再将支持架置于装有2000 ml水的容器中，温室培养8 days。8 days后，用不同浓度的重金属溶液处理大蒜幼苗，各重金属溶液的浓度如下：

Na₃AsO₄：0.5 mM，1 mM，2 mM

CdCl₂：200 uM，500 uM

不同胁迫条件对大蒜幼苗效应的对比实验：

Na₃AsO₄：200 uM

CdCl₂：200 uM

CuSO₄：50 uM

NaCl：50 mM

热处理：45℃，50 min。

于重金属处理的适当时间，分别称取0.5 g大蒜幼苗的根和叶，置于液氮中速冻，然后于-70℃保存备用。

2. NPT和GSH的测定

    1) 将样品于液氮中充分研磨，加入1 ml 5%的磺基水杨酸(ssA)溶液内含6.3 mM DTPA( diethylenetriaminepentaacetate，二乙三胺五乙酸)]，混匀，4℃离心(10，000 X g ) 10 min，取上清，用孔径0.45 um的针筒式微孔滤膜过滤上清，滤液用来检测总谷胱甘肽(GSH)含量和非蛋白巯基(NPT)含量。

    2) 总巯基(NPT)浓度采用Ellman试剂(DTNB)衍生化法。将样品提取液与DTNB的磷酸盐缓冲液(1.8 mM DTNB，0.3 mM KH₂PO₄/K₂HPO₄，15mM Na₂EDTA，PH=7.8)的以1：20 (V/V)混合，吸光度在0.1-0.8范围内。混合后10分钟左右用紫外-可见分光光度计(Ultrospec型，Pharmacia Biotech公司)于412 nm处测定吸光度(标准曲线：y=618.37x )。

    3) GSH的含量采用HPLC (high performance liquid chromatography)的峰而积定量法测定。将样品提取液稀释50倍后进样于HPLC。每次进样前先用流动相D(含0.06% TFA的CH₃CN)冲洗色谱柱30 min，然后用流动相A(含0.06% TFA的H₂O)平衡3 5 min。在上述条件下(洗脱程序：0- 20 min CH₃CN 0-5%，20-40 min CH₃CN 5%，流速0.5 ml/min)进行分析。峰面积采用液相色谱仪配套的Millionium软件自动积分计算。得出的色谱峰而积代入谷胱甘肽浓度-峰而积校正曲线(y=1.3391E 03x，R2=9.9862E-01)，计算出各样品中谷胱甘肽的含量。

    4) 总PCs含量即为NPT含量与GSH含量的差。