微生物细胞大小测定及显微镜直接计数

实验原理

微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体微小，只能在显微镜下测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。

目镜测微尺（图示）是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上，此处正好与物镜放大的中间物像重迭，用于测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。镜台测微尺（图示）是中央部分刻有精确等分线的专用载玻片，一般将1mm等分为100格，每格长10µm即0.01mm，是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成像进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的实际长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物细胞大小。

测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微镜直接计数法和稀释平板计数法。

直接计数法适用于各种单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，则难于直接测定。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼德罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌难于区分。

血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载坡片上有4条槽所构成的3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图示），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格，大方格用三线隔开，而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格，大方格之间用双线分开，而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成（图示）。

计数区边长为1mm，则计数区的面积为1mm²，每个小方格的面积为1/400 mm²。盖上盖玻片后，         

计数区的高度为0.1mm，所以计数区的体积为0.1mm³，每个小方格的体积为1/4000 mm³。

使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每mL菌液（或每g样品）中微生物细胞的数量。

已知：1mL体积＝10 mm×10 mm×10 mm＝1000mm³       

所以：1mL体职应含有小方格数为1000mm³/（1/4000mm³）＝4×10⁶个小方格，即系数K＝4×10⁶。

因此：每mL菌悬液中含有细胞数＝每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d）。

六、实验材料

活材料：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面菌种或培养液、枯草杆菌（Bacillus subtilis）染色标本片。★为什么不选用大肠杆菌作试验菌？

七、实验用品

   显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、盖玻片（22mm×22mm）、载玻片、滴管、双层瓶、擦镜纸、血球计数板、吸水纸、计数器。

八、实验方法

（一）微生物细胞大小的测定

1、目镜测微尺的校正

把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尽与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重迭，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度（图示），计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长10µm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的实际长度。

目镜测微尺每格长度

例如：目镜测微尺5小格正好与镜台测微尺5小格重迭，已知镜台测微尺每小格为10µm

目镜测微尺上每小格长度为。

用同样方法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。

由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在该显微镜上重复使用，当更换不同显微镜目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。刻度重合

2、细胞大小的测定

⑴将酵母菌斜面制成一定浓度的菌悬液（10^－2）。

⑵取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。

⑶移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格，不足一格的部分估计到小数点后一位数。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定10～20个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。待测微生物需用培养至对数生长期的菌体进行测定。

⑷同样方法用油镜测定枯草杆菌染色标本的细胞大小。

（二）微生物细胞的显微直接计数法

1、视待测菌悬液浓度，加无菌水适量稀释（斜面一般稀释到10^－2），以每小格的菌数可数为度。

2、取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。

3、将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴，不宜过多，让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，注意不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片，勿使产生气泡。

4、静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下观察到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应适当关小孔径光阑并减弱光照的强度。

5、计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央1个大方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

6、对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2～3次，每次数值不应相差过大，否则应重新操作，求出每一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每mL(g)菌悬液所含酵母菌细胞数量。

7、测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。