大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶E292对于氨基酰化活性的作用

实验概要

本研究通过基因点突变的方法，将大肠杆菌LeuRS的E292用不同性质的6种氨基酸替换，这些氨基酸包括K(带正电荷的氨基酸)，F(芳香族氨基酸)，S(亲水性小分子氨基酸)，D(比E少一个亚甲基一CHZ一的氨基酸)，Q(去除谷氨酸的负电荷)，A(不带电荷的氨基酸)，得到了该位置点突变的LeuRS变种，研究了纯化后的这些LeuRS变种酶光谱学性质和酶学动力学性质，发现该部位与ATP的结合密切相关，揭示了E292对LeuRS氨基酞化功能的贡献。

主要试剂

L-Leucine，ATP，DTT，焦磷酸钠(tetrasodium pyrophosphate)和HA-Ultrogel购自美国Sigma公司。

[³²p]-焦磷酸钠购自美国杜邦公司。

L-[^I4C]-亮氨酸和DEAE-SepharoseTM Fast Flow购自英国Amersham公司。

限制性内切酶和T4DNA连接酶购自立陶宛MBI Ferments公司。

实验材料

质粒pTrc-99B

大肠杆菌LeuRS

实验步骤

1. 突变体大肠杆菌LeuRS基因的构建

以构建的编码大肠杆菌LeuRS的基因leuS作为模板，利用两步PCR反应扩增得到六个LeuRS变种酶的基因序列(图1)。

第一轮PCR反应的5’和3’引物：引物1和引物4分别具有NcoI和HindIII酶切位点，构建各突变所用的引物如表1所示。PCR反应产物经用NcoI和HindIII双酶切后，嵌入表达载体pTrc-99B的NcoI和HindIII两个酶切位点间的切口内。得到的LeuRS  6个变种酶基因的正确性用DNA测序证实。

2. LeuRS及其变种酶基因的表达和纯化

    1)  将含有LeuRS及其六个变种酶LeuRS-E292K，LeuRS-E292F，LeuRS-E292S，LeuRS-E292D，LeuRS-E292Q，LeuRS-E292A的基因的重组质粒转化到在大肠杆菌菌株TG1中，挑选含有正确质粒的转化子至5  mL氨节-LB液体培养基，37^oC，300 rpm振荡培养转化子至对数生长期。

    2) 用0.5 mM IPTG诱导6小时，取出20ul培养液，加入等体积的SDS-PAGE上样缓冲液，100^oC煮沸10分钟，离心取上清液进行SDS-PAGE检查转化子中各变种酶基因的表达情况。

    3) 将高表达转化子5 mL菌液转接至500 mL氨苄- LB液体培养基中37 ^oC，300 rpm培养至对数生长期，用0.5 mM IPTG诱导8小时，收集菌体。

    4) 将湿菌体悬浮于20毫升0 ^oC预冷的破菌缓冲液(50 mM磷酸钾缓冲液，pH6.8，含10 mM巯基乙醇，2 mM PMSF，10%甘油)中，冰浴超声波破菌。

    5) 将破菌液于4^oC，12，000g离心30分钟后继续经4 ^oC， 150，000g超离心1小时。

    6) 取上清液经过DEAE-SepharoseTM Fast  Flow和HA-Ultrogel两步柱层析纯化。在DEAE-Sephorose CL-6B fast flow纯化中使用的线性洗脱梯度为pH  6.8的磷酸钾缓冲液50 mM-500mM。在HA-Ultrogel纯化中使用的线性洗脱梯度为pH 6.8的磷酸钾缓冲液20 mM-300  mM。

    7) 收集的含LeuRS以及变种酶的洗脱峰，用PEG 20000浓缩，对10 mM pH 6.8的磷酸钾缓冲液透析。加入50% 0 ^oC预冷的甘油，保存于-20 ^oC。

3. 蛋白质浓度测定

粗抽液蛋白质的浓度用Bradford方法测定。纯化后的LeuRS以及变种酶的浓度可以通过以下公式计算得到：1 A₂₈₀=1.62 mg/ml。

4. 酶活力测定

    1) 氨基酸活化反应的条件如下：35ul反应液中含有100 mM HEPES (pH 7.8)，10mM KF，10 mM MgCl₂，4 mM ATP，2 mM [³²P] PPi和1 mM亮氨酸，在37^oC保温，用约4  nmol/L LeuRS起始反应，于不同时间，取出15ul反应液，加入200ul淬灭液中(3.5%高氯酸，2%活性炭和0.05  M焦磷酸钠)停止反应，在淬灭液中再加入5毫升10 mM焦磷酸钠溶液，用Whatman  GF/C滤纸过滤以上溶液，收集吸附ZP-ATP的活性炭粉末，依次用10 mM焦磷酸钠(2x5 ml) 和9  5%乙醇(2x5ml)洗涤和抽干，烘干后，投入闪烁液，计数活性炭粉末吸附的ZP-ATP的量。氨基酸活化反应活力的单位定义为在测定条件下，每分钟催化1纳摩尔PPi形成ATP所需要的酶量。

    2) 氨基酞化反应的条件如下：35ul反应液中含有100 mM Tris-HCl (pH7.8)，30 mM KCl，12 mMMgC1₂，4 mM ATP，0.1 mM EDTA，0.5 mM DTT，20uM tRNA^lue，0.1 mM亮氨酸在37^oC保温，用约5 nM LeuRS起始反应。不同时间取15ul反应液滴在Whatman 3#滤纸上，放置5秒钟后，将纸片投入5%三氯乙酸中(含有5 mM亮氨酸)，0^oC浸泡10分钟，换2次5%三氯乙酸溶液，再用9 5%乙醇浸泡两次，烘干滤纸片。投入PPO/POPOP闪烁液((5 g PP 0.25 g POPOP溶解于1L甲苯)，液闪计数。

    3) 氨基酞化反应活力单位定义为：在测定条件下，每分钟催化产生1纳摩尔亮氨酞-tRNA^leu所需的酶量。

5. CD光谱和荧光光谱的测定

测定CD光谱所使用的仪器为Jasco J-715型圆二色性仪。蛋白质样品在10 mM磷酸钾溶液((pH 6.8)中的浓度为0.2  mg/ml，测定温度为室温，所用比色杯的光径为0.lcm。荧光光谱的测定在日本Hitachi  F-4010荧光分光光度计上进行。测定发射光谱时，激发波长为295 nm，狭缝为3 nm，发射光谱扫描范围为300-400  nm。荧光杯的光路长为1 cm。蛋白质样品在10 mM磷酸钾溶液(pH 6.8)中的浓度为0.1 mg/ml。