小鼠心脏组织蛋白样品的蛋白质组学分析

实验概要

本实验提供了一个心脏组织2-DE蛋白样品制备及检测的流程，为蛋白质双向电泳实验做好准备。

实验步骤

1. 心脏组织2-DE蛋白样品的制备

    1) 将冷冻的小鼠心脏组织在液氮条件下研磨成粉末；

    2) 然后加入5 x体积蛋白裂解液(7 M Urea, 2 M Thiourea, 40 mM Tris, 4 % CHAPS, 65mMDTT, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 5 mM protease inhibitor cocktail, 0.5% Pharmaltes, pH3-10)，用Teflon匀浆器匀浆组织1 min，超声匀浆30s；

    3) 室温放置10 min，4^oC；

    4) 14,000 g离心30 min，收集上清，-80^oC储存备用。蛋白质裂解液保存在-20^oC冰箱里备用。

2. 蛋白质含量测定

按Amersham 2-D Quant Kit操作说明进行:

    1) 取3ul蛋白样品进行定量，每管样品加入500ul沉淀剂(precipitant)，漩涡振荡，室温下放置2-3 min；

    2) 加入500 ul共沉淀剂(co-precipitant)，混匀；

    3) 4℃，10,000 g离心5 min；

    4) 弃上清，尽量没有可见液体残余，加入100ul铜溶液(copper solution)，和400ul去离子水，漩涡振荡使蛋白沉淀溶解；

    5) 加入1 ml显色工作液(working color reagent, color reagent A :color reagent B=100:1)，快速混匀，室温下放置15^'20 min; 490 nm处测定吸收峰；

    6) 所得结果根据标准曲线计算样品蛋白含量。