重组质粒的连接、转化及筛选

实验概要

本技术以pBS质粒、E. coli DH5α为例介绍了重组质粒的连接、转化及筛选。

实验原理

本实验所使用的载体质粒DNA为pBS，转化受体菌为E.coli DH5α菌株。由于pBS上带有Ampr 和lacZ基因，故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与α-互补现象筛选相结合的方法。

因pBS带有Ampr 基因而外源片段上不带该基因，故转化受体菌后只有带有pBS DNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来；而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。

pBS上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点，但并没有破坏lacZ的阅读框架，不影响其正常功能。E.coli   DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下，pBS和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac    细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变，表达蛋白失活，产生的氨基酸片段失去α-互补能力，因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac   细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为α-互补现象筛选。

主要试剂

1. 连接反应缓冲液(10×)：0.5mol/L Tris•Cl (pH7) 6)，100mol/L MgCl₂，100mol/L 二硫苏糖醇(DTT)(过滤灭菌)，500μg/ml 牛血清清蛋白(组分V) Sigma 产品)(可用可不用)，10mol/L ATP(过滤灭菌)。

2. T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase)；购买成品。

3. X-gal储液(20mg/ml)：用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液，包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏，储存于-20℃。

4. IPTG储液(200mg/ml)：在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后，用蒸馏水定容至1ml，用0) 22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。

5. 麦康凯选择性培养基(Maconkey Agar)：取52g麦康凯琼脂加蒸馏水1000ml，微火煮沸至完全浴解，高压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50mg/ml，然后摇匀后涂板。

6. 含X-gal和IPTG的筛选培养基：在事先制备好的含50μg/ml Amp的LB平板表面加40ml X-gal储液和4μlIPTG储液，用无菌玻棒将溶液涂匀，置于37℃下放置3-4小时，使培养基表面的液体完全被吸收。

7. 感受态细胞制备相关试剂。

8. 煮沸法快速分离质粒相关试剂。

9. 质粒酶及电泳试剂。

主要设备

恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳装置，电热恒温培养箱，电泳仪无菌，工作台，微量移液枪，eppendorf管。

实验材料

外源DNA片段：自行制备的带限制性末端的DNA溶液，浓度已知；

载体DNA： pBS质粒(Ampr ，lacZ)，自行提取纯化，浓度已知；

宿主菌： E.coli DH5α，或JM系列等具有α-互补能力的菌株。

实验步骤

1. 连接反应

    1) 取新的经灭菌处理的0.5ml eppendorf管，编号。

    2) 将0.1μg载体DNA转移到无菌离心管中，加等摩尔量(可稍多)的外源DNA片段。

    3) 加蒸馏水至体积为8μl，于45℃保温5分钟，以使重新退火的粘端解链。将混和物冷却至0℃。

    4) 加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl， T4 DNA ligase 0.5μl，混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底，于16℃保温8-24小时。

同时做二组对照反应，其中对照组一只有质粒载体无外源DNA；对照组二只有外源DNA片段没有质粒载体。

2. E.coli DH5α感受态细胞的制备及转化

每组连接反应混和物各取2μl转化E.coli DH5α感受态细胞。具体方法如下：

    1) 从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。

    2) 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng，体积不超过10μl，轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。

    3) 42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。

    4) 向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。

    5) 将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。

同时做两个对照：

对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。

对照组2：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

3. 重组质粒的筛选

    1) 每组连接反应转化原液取100μl用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上，37℃下培养半小时以上，直至液体被完全吸收。

    2) 倒置平板于37℃继续培养12-16小时，待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。

    3) 放于4℃数小时，使显色完全(此步麦康凯培养基不做)。

不带有pBS质粒DNA的细胞，由于无Amp抗性，不能在含有Amp的筛选培养基上成活。带有pBS载体的转化子由于具有β-半乳糖苷酶活性，在麦康凯筛选培养基上呈现为红色菌落。在X-gal和ITPG培养基上为蓝色菌落。带有重组质粒转化子由于丧失了β-半乳糖苷酶活性，在麦康凯选择性培养基和x-gal和ITPG培养基上均为白色菌落。

4. 酶切鉴定重组质粒

用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含Amp 50μg/ml的 5ml  LB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时。使用煮沸法快速分离质粒DNA直接电泳，同时以煮沸法抽提的pBS质粒做对照，有插入片段的重组质粒电泳时迁移率较pBS慢。再用与连接未端相对应的限制性内切酶进一步进行酶切检验。还可用杂交法筛选重组质粒。

注意事项

1. DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。

2. 在连接带有粘性末端的DNA片段时，DNA浓度一般为2-10mg/ml，在连接平齐末端时，需加入DNA浓度至100-200mg/ml。

3. 连接反应后，反应液在0℃储存数天，-80℃储存2个月，但是在-20℃冰冻保存将会降低转化效率。

4. 粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4 DNA连接酶的最适反应温度为37℃，在连接粘性末端时，反应温度以10-16℃为好，平齐末端则以15-20℃为好。

5. 在连接反应中，如不对载体分子进行去5'磷酸基处理，便用过量的外源DNA片段(2-5倍)，这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。

6. 麦康凯选择性琼脂组成的平板，在含有适当抗生素时，携有载体DNA的转化子为淡红色菌落，而携有带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落。该产品筛选效果同蓝白斑筛选，且价格低廉。但需及时挑取白色菌落，当培养时间延长，白色菌落会逐渐变成微红色，影响挑选。

7.  X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶(b-galactosidase)水解后生成的吲哚衍生物显蓝色。IPTG是异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylthiogalactoside)，为非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ的表达。

8. 在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37℃培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显。