实验概要
掌握培养细胞中RNA的检测方法。
实验步骤
1.制胶(1%):
琼脂糖 2.5g
10×Mops缓冲液 25.0ml
H2O 192.0ml
2.在微波炉中加热煮沸使胶完全溶于水并灭菌。
3.取出胶冷却到60℃,于通风柜中加45ml甲醛,混匀。
4.加20μl溴化乙锭,混匀。
5.令胶液再冷却10分钟。
6.将其倒入四面封好的电泳槽中,加样品梳,约20分钟形成电泳凝胶。
7.加入1×Mops缓冲液于电泳槽,盖满胶表面,但不>1cm。
8.取10~15μg RNA样品,真空离心干燥,再溶于20μl载样缓冲液,加热95℃ 2分钟,使RNA变性。
9.每孔中20μl RNA点样,同时加一标准物。
10.一般35V电泳,从下午4:00pm~9:30am。
11.取出胶在紫外灯下观察,将刻度尺放在胶旁照像。成功的电泳在胶上28S(约5kb)18s(约2kb)处可见明显的溴化乙锭带。
12.用500ml 10SSC浸泡洗涤胶2次,每次20分钟,去除甲醛。
13.其它吸印步骤完全与Southern Blot相同,只是吸印缓冲液为10×SSC。
14.室温下至少吸印12小时。
15.吸印完成后,取出胶与滤膜,表明加样起始部位、膜的方向及标号、用Whatman滤纸包好,80℃真空干燥2小时;如为尼龙膜在紫外灯下照射5分钟。
16.分子杂交:杂交原理与Southern Blot相同,但所用杂交液及杂交、洗涤温度与之不同。预杂交液制备:
50%甲酰胺
1% SDS
1M NaCl
10%硫酸葡聚糖
17.将滤膜放入塑料袋,加入10ml预杂交液,去除气泡后封袋,在42℃水浴中振荡至少6小时。
18.制备变性鱼精DNA≥100μg/ml,变性同位素标记的探针(加入袋中的终浓度≤10ng/ml或1~4×105dpm/ml)。
19.将此液0.5~1ml以针头注入含预杂交液的塑料袋中,排除气泡,从针眼处重新封死塑料袋,再用玻棒在袋上赶几次,使探针与预杂交液充分混匀,42℃振荡水浴6~42小时。
20.膜的洗涤:
1) 2×SSC 100ml室温中振荡5分钟,共2次。
2) 1%SDS,2×SSC 200ml, 60℃振荡30分钟,共2次。
3) 0.1×SSC 100ml室温振荡30分钟,共2次。
21. 膜在室温中自然干燥后,用塑料纸包好即可进行放射自显影过程(同DNA检测)。