实验概要
本文介绍了单糖发酵试验、V-P(Voges-Proskauer)试验、甲基红试验、枸橼酸盐利用试验、靛基质（Indol）试验、硫化氢（H2S）产生试验、尿素分解试验、及氧化酶试验的原理和基本方法。
实验原理
1. 单糖发酵是将葡萄糖，乳糖或麦芽糖等分别加入蛋白胨水培养基内，使其最终浓度为0.75~1％。并加入一定量酚红指示剂及小倒管，制成单糖发酵管，接种细菌经37℃培养18~24小时，若能分解糖产酸则酚红指示剂由红变黄，若能分解甲酸有CO2和H2等气体形成，小倒管内则聚集有气泡；不分解，则指示剂不变色。
2. 有些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧，生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境中被氧化为二乙酰，再与培养基内胍基结合，生成红色化合物，V—P试验阳性。
3. 某些细菌如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，继而分解为甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基PH值降至4.5以下，加入甲基红指示剂呈红色，此为阳性反应；若产酸量少或产生的酸进一步转化为醇、醛、气体和水等，则培养基的酸碱度仍在pH 6.2以上，加入甲基红指示剂呈现黄色，为阴性反应。
4. 枸橼酸盐培养基系一综合性培养基，其中枸橼酸钠为唯一碳源，磷酸二氢铵为唯一氮源。一般细菌能利用磷酸二氢铵作为氮源，但不一定能分解枸橼酸盐取得碳源。因此，根据可否利用枸橼酸盐来鉴别细菌，如产气杆菌可利用枸橼盐作为碳源，细菌生长繁殖，形成菌苔，分解枸橼酸盐生成碱性碳酸盐，使培养基pH上升到7.0以上，由绿色变为深兰色，为枸橼酸盐利用试验阳性；而大肠杆菌则不能分解枸橼酸盐，得不到碳源，不能生长，无菌苔形成，培养基颜色不发生变化，为枸橼酸盐利用试验阴性。
5. 某些细菌如大肠杆菌，变形杆菌等具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水培养基中的色氨酸，产生靛基质（无色吲哚），再与欧立希试剂（对二甲基氨基苯甲醛）反应，形成红色化合物—玫瑰吲哚，即为阳性反应。
6. 某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸），生成硫化氢。硫化氢遇到培养基中的铅盐（醋酸铅）或铁盐（硫酸亚铁），则形成黑褐色硫化铅或硫化亚铁沉淀物。培养基内含有还原剂硫代硫酸钠，使形成的硫化氢不再氧化。
7. 某些细菌如变形杆菌，具有尿素分解酶，能分解尿素而产生氨，氨溶于水变成氢氧化铵，使培养基变碱而呈红色即为阳性。
8. 某些细菌如奈瑟菌和绿脓杆菌，具有氧化酶（靛基酚氧化酶），能将氧化酶试剂（盐酸二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺）氧化成红色的醌类化合物，即为氧化酶试验阳性。
主要试剂
1. 单糖发酵试验培养基：葡萄糖发酵管，乳糖发酵管等。
2. V-P(Voges-Proskauer)试验培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。试剂：V-P试剂[40％氢氧化钾水溶液(内含0.3％肌酸)和6%α-奈酚酒精溶液]。
3. 甲基红试验培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。试剂：甲基红试剂。
4. 枸橼酸盐利用试验培养基：枸橼酸盐斜面。
5. 靛基质（Indol）试验培养基：蛋白胨水培养基。试剂，欧立希（Ehrlich）试剂（对二甲基氨基苯甲醛）。
6. 硫化氢（H2S）产生试验培养基：醋酸铅培养基。
7. 尿素分解试验培养基：尿素培养基。
8. 氧化酶试验培养基：巧克力平板。试剂：0.5-1%盐酸对二甲基苯胺（或盐酸二甲基对苯二胺或盐酸对氨基二甲苯胺）水溶液。
实验材料
1. 单糖发酵试验菌种：大肠杆菌，伤寒杆菌18~24小时琼脂斜面培养物。
2. V-P(Voges-Proskauer)试验菌种：大肠杆菌，产气杆菌18~24小时琼脂斜面培养物。
3. 甲基红试验菌种：大肠杆菌，产气杆菌18~24小时琼脂斜面培养物。
4. 枸橼酸盐利用试验菌种：大肠杆菌，产气杆菌18~24小时琼脂斜面培养物。
5. 靛基质（Indol）试验菌种：大肠杆菌，伤寒杆菌18~24小时琼脂斜面培养物。
6. 硫化氢（H2S）产生试验菌种：大肠杆菌，伤塞杆菌18~24小时琼脂斜面培养物。
7. 尿素分解试验菌种：变形杆菌，伤寒杆菌18-24小时琼脂斜面培养物。
8. 氧化酶试验菌种：淋球菌或脑膜炎球菌，白色葡萄球菌18-24小时巧克力斜面培养物。
实验步骤
1. 单糖发酵试验
(1). 将伤寒杆菌，大肠杆菌按照液体接种方法分别接种于葡萄糖及乳糖发酵管内。
(2). 置37℃孵箱培养18~24小时。
(3). 观察结果：由于一些细菌能分解某种糖类产酸，所以培养基中pH下降到7.0以下，在酚红指示剂的显示下，培养基颜色由红变黄。产酸者以“ ”表示，如果同时产生气体，则培养基中小倒管内有气泡出现，此乃产酸又产气，以“⊕”表示，不分解，则指示剂不变色，用“-”表示。
(4). 实验结果
伤寒杆菌大肠杆菌
葡萄糖 ⊕
乳糖 - ⊕
2. V-P(Voges-Proskauer)试验
(1). 分别接种大肠杆菌，产气杆菌于两支葡萄糖蛋白胨水中。
(2). 置37℃培养48小时后，取出分别加入KOH1ml和α-奈酚溶液1ml ,摇匀，静置试管架上5~15分钟。
(3). 实验结果
培养液变为红色为阳性，不变色为阴性。
3. 甲基红试验
(1). 分别将大肠杆菌，产气杆菌接种于两支葡萄糖蛋白胨水培养基中。
(2). 置37℃培养2~3天取出，分别滴加甲基红试剂2~3滴，混匀，观察结果。
(3). 实验结果
大肠杆菌： ，产气杆菌：-。
4. 枸橼酸盐利用试验
(1). 分别将大肠杆菌，产气杆菌接种于两支枸橼酸盐斜面培养基。
(2). 置37℃恒温培养24小时后观察结果。
(3). 实验结果
产气杆菌： （有菌苔生长，培养基变色）
大肠杆菌：-（无菌苔生长，培养基不变色）
5. 靛基质（Indol）试验
(1). 分别将大肠杆菌，伤寒杆菌接种于两支蛋白胨水培养基中。
(2). 置37℃培养2~3天后，每管沿管壁各加欧立希试剂0.5~1ml于培养液面上，待1-2分钟后观察结果：在交界面出现玫瑰红色环即为吲哚试验阳性，无红色环即为阴性。
(3). 实验结果
大肠杆菌： ；伤寒杆菌：- 。
6. 硫化氢（H2S）产生试验
(1). 分别以半固体穿刺接种法将大肠杆菌，伤寒杆菌穿刺接种地两支醋酸铅培养基内。
(2). 置37℃培养48-72小时（2-3天）。
(3). 观察结果：取出后对光观察，若沿穿刺线有黑褐色沉淀物，即表示该菌能产生硫化氢（H2S），否则反之。
(4). 实验结果
大肠杆菌：-（无黑色沉淀线生成）
伤寒杆菌： （有黑色沉淀线生成）
7. 尿素分解试验
(1). 分别以斜面接种法将变形杆菌，伤寒杆菌接种于两支尿素斜面培养基上。
(2). 置37℃培养18-24小时。
(3). 取出观察结果，培养基变为红色，即尿素分解试验阳性，若不变色，即为尿素分解试验阴性。
(4). 实验结果
变形杆菌： ；伤寒杆菌：- 。
8. 氧化酶试验
(1). 将脑膜炎球菌或淋球菌，白色葡萄球菌分别接种于巧克力平板；
(2). 置37℃培养24小时后取出；
(3). 滴加新鲜配制的0.5-1%盐酸对二甲基苯胺水溶液于固体培养基上；
(4). 观察结果：加试剂后，若菌落出现红色→深红色→紫黑色变化均为阳性；反之阴性。
(5). 实验结果
脑膜炎球菌和淋球菌： ；白色葡萄球菌：- 。
注意事项
1. 氧化酶试验应避免含铁物质，因遇铁会出现假阳性；试剂在空气中易氧化，故应新鲜配制，冰箱保存使用不超过两周；若要分离培养脑膜炎球菌，应在菌落变成紫黑色之前立即转种。否则细菌容易死亡。
2. 《附录》
(1). V-P试验剂的配制
甲液：α-萘酚 6g 95%洒精 100ml
乙液：KOH 40g 肌酸0.3g 蒸馏水 100ml
(2). 甲基红试剂的配制
甲基红 0.04g 95%酒精 60ml 蒸馏水 40ml
先使甲基红溶解于酒精中，再加入蒸馏水，混合，摇匀即成。
(3). 欧立希（Ehrlich）试剂的配制
对位二甲基氨基苯甲醛 4g
95%酒精 380ml
浓硫酸或浓盐酸80ml
三种成分混合即成，瓶口要严密，以免挥发。
(4). 蛋白胨水培养基的制备
成分：蛋白胨10g 氯化钠5g 蒸馏水1000ml
制法：
1). 先用少量蒸馏水将蛋白胨和氯化钠相混合溶解,再加足蒸馏水量。
2). 调节pH至7.6、用滤纸过滤。
3). 分装中试管，每管约3-4ml，加塞灭菌后备用。
用途：供吲哚试验用
(5). 单糖发酵管的制备
成分：蛋白胨水培养基 100ml
0.2%酚红 1ml
所需糖（葡萄糖或乳糖）0.75-1g
制法：
1). 将上述成分溶化，混匀分装于内含有倒置小玻璃管的小试管中，每管约2ml，加塞。
2). 小倒管排气，灭菌（8-10磅，20-30分钟），贮存备用。
用途：供单糖发酵试验用。
附注：0.2%酚红配制法
酚红（phenol red）0.2g
1/10苛性钠（NaOH） 8ml
蒸馏水 92ml
将酚红入研钵徐徐加入苛性钠研磨，再补足蒸馏水即成。若需长时间保存，可高压灭菌后贮存备用。
(6). 葡萄糖蛋白胨水培养物
成分：蛋白胨5g 葡萄糖5g
制法：
1). 将上述成分溶解于蒸馏水中。
2). 调节pH至7.6，用滤纸过滤除渣。
3). 分装中试管，每管约3-4ml，灭菌后备用。
用途：供甲基红及V-P试验用。
(7). 枸橼酸盐斜面培养基的制备
成分：磷酸二氢铵0.1g 磷酸氢二钾0.1g
硫酸镁0.02g 枸橼酸钠0.23g
氯化钠0.5g 琼脂2g
蒸馏水100ml 0.5%溴麝香草酚蓝酒精溶液2ml
制法：
1). 先将上述各种盐类溶解于蒸馏水中，使其完全溶解。
2). 矫正pH至6.8，然后加入琼脂和指标剂。
3). 摇匀，脱脂棉过滤，分装中试管，每管约3-5ml。
4). 灭菌后置成斜面备用（冷后为绿色）
用途：供枸橼酸盐利用试验用。
(8). 醋酸铅培养基的制备
成分：2%肉汤琼脂200ml 硫代硫酸钠0.05g
醋酸铅10g 蒸馏水100ml
制法：
1). 先将10g醋酸铅加入100ml蒸馏水中融化，间歇灭菌或低压菌后备用（10%醋酸铅溶液）。
2). 加热溶化2%肉汤琼脂200ml，加入硫代硫酸钠0.05g，混合后高压灭菌。
3). 从高压灭菌锅取出，待冷却至45℃左右时。无菌操作加入无菌的10%醋酸铅溶液1毫升，摇匀。
4). 分装小试管，每管约2ml，直立待冷凝后备用。
用途：供硫代氢生成试验用。
说明：醋酸铅与硫代硫酸钠不宜久然。
(9). 尿素培养基的制备
成分：蛋白胨1g 氯化钠5g
葡萄糖1g 蒸馏水900ml
琼脂15~20g 0.1%酚红 12ml
20%尿素水溶液（无菌）100ml
制法：
1). 除尿素、琼脂和酚红外，其余成分溶于水中，加热溶化，矫正pH至6.8~6.9。
2). 加入琼脂和酚红，8~10磅10分钟灭菌。
3). 冷却至60℃后加入无菌尿素溶液，摇匀。
4). 分装中试管（无菌），每管3~4ml，置成斜面备用。
用途：供尿素分解试验用。
说明：
1). 尿素不耐热，也不能久存，只能用滤器除菌。
2). 无菌尿素溶液制备：称取尿素20g，混合于100ml蒸馏水中，充分摇匀，用G6滤菌器过滤除菌，以达到无菌的目的。
(10). 巧克力色琼脂平板的制备
成分：肉汤琼脂100ml 无菌脱纤维羊或兔血10ml。
制法：
1). 将肉汤琼脂加热溶化，趁热加入脱纤维血，摇匀。
2). 倾注平板，待冷却成巧克力色，备用。
用途：用于培养脑膜炎双球菌或淋球菌。
说明：加血一定要趁热加。
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