PCR－SSCP标记技术

实验概要

日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开.作者称该方法为单链构象多态性  (Single-Strand Conformation  Polymorphism，SSCP)分析.在随后的研究中，作者又将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而建立了PCR-SSCP技术，进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性.其基本过程是：①PCR扩增靶DNA；②将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；③将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果.若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变.该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，适合临床实验的需要.但它也有不足之处.例如，只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序;电泳条件要求较严格;另外，由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检.尽管如此该方法和其他方法相比仍有较高的检测率.首先，它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变.Takao，经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来.另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯.用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段。

主要试剂

丙烯酰胺 TBE 变性剂石蜡油乙醇冰醋酸 AgNO₃ NaCO₃  1Kb Mark  taq酶相应引物 dNTP等

实验步骤

 在小于1Kb长度的情况下，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:

在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾)。

　　1.制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)

　　按上表制所需的胶液，将梳子插入模子，从梳子一端加入胶，当胶液快到梳齿时，使模子向加胶端倾斜，继续慢慢加胶，边加边放端模子以防止气泡形成，室温放置1h使 之凝固.然后拔掉梳子，顶部加入1×TBE封闭，备用.

　　2.电泳

　　取10μlPCR产物，加入10μl变性剂(95%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.02%溴酚蓝)、30μl  石蜡油，煮沸5min，取出立刻放入冰浴中2min以上，然后将水相全部上样，10-15℃下  电泳.开始在300V电压下电泳5min，然后在120V电泳8h，取下凝胶，将其浸在含  0.5ug/ml溴化锭的1×TBE缓冲液中染色30--45min，在紫外灯下观察，或进行银染.

　　3.银染法

　　将PAG板用去离子水洗二次，浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min.用去离子水洗二次，再浸入0.2%AgNO3溶液中10min.用去离子水洗3--5次，然后浸入1.5%NaOH和 0.4%甲醛溶液中显色7min.最后，用0.75%NaCO₃终止显色.

注意事项

SSCP是一种快速、简便、灵敏的检测基因突变的方法，为了使SSCP达到最佳效果，应 注意下列事项.

　　①重复性.影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度.这两个条件保持不变，  SSCP图谱可保持良好的重复性.一般SSCP图谱是二条单链DNA带，但有时有的DNA片段  可能只呈现一条SSDNA带，或者三条以上，这主要是由于两条单链DNA之间存在相似的  立体构象.有时三条以上的SSCP图谱是由于野型DNA片段和突变型DNA片段共同存在的 结果.

　　②靶DNA序列长度的影响在实验中发现SSCP对短链DNA或RNA的点突变检出率要比长链  的高，这可能是由于长链DNA和RNA分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用  较小的缘故.而有人认为在DNA链较短的(400bp以下)情况下，DNA的长度不会影响SSCP  的效果.他们仔细选择了实验条件，发现354bp的DNA中点突变的检出率仍可达到90%以 上.

　　③电泳电压和温度的影响:为了使单链DNA保持一定的稳定立体构象，SSCP应在较低温度下进行(一般4℃-15℃之间).在电泳过程中除环境温度外，电压过高也是引起温度升高的主要原因，因此，在没有冷却装置的电泳槽上进行SSCP时，开始的5min应用较高的电压(250V)，以后用100V左右电压进行电泳.这主要是由于开始的高电压可以使不同立体构象的单链DNA初步分离，而凝胶的温度不会升高.随后的低电压电泳可以使之进一步分离.在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压.