实验概要
限制酶主要存在原核细胞中。多数来源于细菌，有的来源于蓝藻和链霉菌，极少数来源于支原体等微生物中，存在原核细胞的限制酶能在特异的识别位点切断外源DNA，如感染的噬菌体。而宿主细胞内的DNA则因它的一些特异识别位点常常由于其中一个碱基的甲基化被保护起来，从而使此位点不再成为限制酶的底物。限制性内切酶能特异地结合的一段DNA序列被称为限制性识别序列，其长度一般为4-6个核苷酸，且呈二重对称，或称之为回文序列。质粒酶切和线性DNA基因酶切首先要弄清楚它们的基本酶切位点（附图）。目前许多限制性内切酶的位点已被确定例如：EcoRI切割位点为：5’ G A A T T C 3’
3’ C T T A A G 5’
主要试剂
λDNA: 购买或自行提取纯化；重组pBS质料或pUC19质粒；EcoRI酶及其酶切缓冲液；购买成品；HindⅢ酶及其酶切缓冲液：购买成品；琼脂糖(Agarose)：进口或国产的电泳用琼脂糖均可、双蒸水或超纯去离子水。
实验步骤
（一）DNA酶切反应
（1） 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf编号，用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2 μl，再加入重蒸水使总体积为19 μl，将管内溶液混匀后加入1 μl酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。
（2） 混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上，37℃水浴保温2～3小时，使酶切反应完全。
（3） 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA（PH8.0），混匀以停止反应(可做可不做)，置于冰箱中保存备用。
（二）DNA电泳分析
取2μl 以上酶切DNA样品在1%Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小。
注意事项
1、酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。
2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1mg lDNA的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA不象lDNA那样易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。
3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶活性将受影响。
4、观察DNA离不开紫外透射仪,可是紫外光对DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时,应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm）,以减少紫外光切割DNA。
5、EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
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