实验概要
掌握质粒DNA双酶切的原理和操作方法。
实验原理
分子生物学实验中,基因的重组与分离涉及到一系列的酶促反应。许多种酶在基因克隆实验中有着广泛的用途。
限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。多种细菌能合成限制性核酸酶,这是它们保护自己,降解外来DNA分子的重要手段。每一种内切酶能识别DNA分子中由4~6个核苷酸组成的特定序列。而细菌细胞内的DNA则由于相应序列上的A或C碱基的甲基化而不被攻击,可是外源DNA一旦进入细胞立即被识别,双股DNA螺旋都被切断。限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要工具,所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具,而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。
寄主控制的限制与修饰现象:限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶,它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内,但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响,因为这种细胞还合成了一种修饰酶,对自身的DNA进行了修饰,限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。
限制性核酸内切酶的类型及特性,按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同,分为三类:
1. 第一类(I型)限制性内切酶:
能识别专一的核苷酸顺序,并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链,但是切割的核苷酸顺序没有专一性,是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大,无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。
2. 第二类(II型)限制性内切酶:
能识别专一的核苷酸顺序,并在该顺序内的固定位置上切割双链。这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的,因此,这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸,少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。
II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序,即有一个中心对称轴,从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式:
粘性末端:
交错切割,结果形成两条单链末端,这种末端的核苷酸顺序是互补的,可形成氢键,所以称为粘性末端
如EcoRI的识别顺序为:
5'…… G'AA|TT_C ……3'
3'…… C_TT|AA'G …… 5'
垂直线表示中心对称轴,从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG,这就是回文顺序(palindrome)。_和'表示在双链上交错切割的位置,切割后生成
5'G……… 5'.AATTC
3'CTTAA.和3'……...G二个DNA片段,各有一个单链末端,二条单链是互补的,其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。
平头末端:
II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链,产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是:
5'…… GAT'|ATC …… 3'
3'…… CTA'|TAG …… 5'
切割后形成5'…… GAT ATC …… 3'
3'……CTA和 TAG……5'二个片段,这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。
3. 第三类( III型)限制性内切酶:
也有专一的识别顺序,但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此,这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段,具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。
主要试剂
1. R-pGEX-4T-1质粒DNA
2. XhoⅠ酶(TaKaRa公司)
3. EcoRⅠ酶(TaKaRa公司)
4. 10×H Buffer(TaKaRa公司)
5. 无菌水
6. DNA marker 2000(TaKaRa公司)
7. 琼脂糖
8. 1×TAE
9. 10mg/mL溴化乙锭溶液(EB)(0.5μg/mL终浓度,20mL胶加1μL)
10. 10×Loading Buffer:1%SDS/50%Glycerol(甘油)/0.05%Bromophenol Blue(溴酚蓝)
主要设备
1. 琼脂糖凝胶电泳系统(电泳槽、电泳仪和制胶装置)
2. 紫外线透射仪
3. 水浴锅
4. 10μL移液枪和枪头
5. 制冰机
6. 浮板
实验步骤
1. 质粒DNA的双酶切
反应体系:
EcoRⅠ1μL
XhoⅠ1μL
10×H Buffer2μL
质粒DNA10μL~12μL≤1μg
无菌水6μL~4μL
总体积20μL(无菌水补至总体积)
反应条件:温度37℃,酶切1小时30分钟。
2. 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果
制备1%琼脂糖凝胶(含0.5μg/mLEB),100V电泳25~30分钟,最高电压不超过5V/cm。
3. 紫外线透射仪观察结果
4. UVP凝胶成像系统记录结果(电泳图)
注意事项
酶切是要注意影响核酸限制性内切酶活性的因素,如:
1. DNA的纯度
2. DNA的甲基化程度
3. 酶切消化反应的温度
4. DNA的分子结构
5. 溶液中离子浓度及种类
6. 缓冲液的 pH值等