下面为美国标准细胞库或细胞银行（ATCC）入库细胞的基本要求：
（1）培养简历 组织来源日期、物种、组织来源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态，细胞已传代数等。
（2）冻存液 培养基和保护剂名称。
（3）细胞活力 冻融前后细胞接种存活率和生长特性(生长繁殖曲线，分裂指数等)。
（4）培养液 培养基种类和名称、血清来源及浓度。
（5）细胞形态 类型，如上皮或成纤维细胞等。
（6）核型 二倍体或多倍体，标记染色体有或无。
（7）无污染情况 包括细胞、真菌、支原体、原虫和病毒等。
（8）物种检测 检测同功酶，主要为G6PD和LDH，以证明细胞有无交叉污染。
（9）免疫检测 一两种血清学检测。
（10）细胞建立者 建立者姓名、检测者姓名。
第四节 细胞的纯化和克隆
体外培养的细胞源于人或动物体内或胚胎组织，其体内的细胞都是混杂生长，每一种组织都有血管和间叶组织，因此，来源于上述组织的培养材料的原代细胞、传代细胞绝大多数都呈混合生长，即有上皮样细胞，又有纤维样细胞，纤维样细胞又包括成纤维细胞、肌细胞、骨细胞、滑膜细胞等，混杂的细胞会直接影响实验结果，而利用体外培养细胞进行实验研究时，为了保证实验结果的可靠性、一致性、稳定性和可重复性，要求采用单一种类细胞来进行实验，这样才能对某一细胞的功能、形态等变化进行一系列研究，因而培养细胞的纯化就成为实验研究的重要一步，甚至需要从混杂的细胞群中分离出单个细胞来进行培养和开展实验研究。
一、细胞的纯化
细胞的纯化一般分为两种，即自然纯化和人工纯化。可根据不同细胞种类、来源、实验要求和目的选择采用。
(一)自然纯化
自然纯化即利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程中靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞，靠自然增殖的潜力，最后留下生长优势旺的细胞，达到细胞纯化的目的。但这种方法常无法按照需要和实验要求及目的来选择细胞，此法花费时间长，留下来的往往是成纤维细胞。仅有那些恶性变的肿瘤细胞或突变的细胞可以通过此方法而保留下来，不断纯化而建立细胞系。
(二)人工纯化
人工纯化，即利用人为手段造成某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长从而达到纯化细胞的目的。
1、细胞因子依赖纯化法
人和动物组织中某些细胞需要有特殊的细胞因子存在的微环境才能长期存活和生长繁殖，如IL-2是T细胞生长所必需的细胞因子，BCGF是B细胞的生长因子，体外培养中淋巴细胞若加入IL-2就可使T细胞生长繁殖，形成IL-2依赖的T细胞系，如CTLL-2细胞株，而其他细胞则自然被淘汰，采用此法还建立了IL-6依赖的细胞系，如B9、CTD7细胞株。
2、酶消化法
酶消化法是比较常用的纯化方法，不仅对贴壁细胞可行，能利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，使两者分开，达到纯化的目的，对贴壁细胞与半贴壁及粘附细胞间的分离纯化也是十分有效的。
（1）上皮细胞与成纤维细胞的分离纯化
两者在胰蛋白酶的作用下，由于成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁，特别是在原代细胞初次传代和早期传代中两种差别尤为明显，故可采用多次差别消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开。
方法如下：
①采用常规消化传代方式 将0.25%胰蛋白酶注入培养瓶内两次，每次加1mL（25mL培养瓶）来回轻摇1-2次，使胰蛋白酶流过所有细胞表面，然后倒掉。
②盖好瓶塞（或盖），将培养瓶放在倒置显微镜下观察，发现纤维样细胞变圆，部分脱落，立即加入2mL有血清的培养液终止消化。
③用弯头吸管轻轻吹打纤维样细胞生长的区域（可事先在镜下用记号笔在培养瓶上划出记号）。吹打时不要用力，也不要吹打上皮细胞生长区域。吹打结束后，再用少量培养液漂洗一遍，然后加入适量培养液于瓶内继续培养，也可重复上述操作再进行一次，隔几日后或下次传代时，再进行上述操作，经过几次处理，就可将成纤维细胞去除或将两者分开。
（2）骨髓基质肌样细胞的纯化
在血液细胞和骨髓细胞静置培养时，常有许多肌样细胞和骨髓基质细胞贴壁生长，但也有许多淋巴细胞、单核细胞、粒细胞粘附其上，种类混杂，鉴于粘附细胞贴壁不牢固，也可用酶消化法使粘附细胞脱壁分离，以达到骨髓基质细胞或血液中肌样细胞与淋巴细胞分开和纯化的目的。
其方法如下：
①待基质或肌样细胞基本形成单层时，倒去旧液，加入无钙、镁PBS漂洗，并用力摇动后倒掉，反复洗2~3次后，一方面可洗去血清和钙镁离子以助酶消化，另一方面又可使大部分粘附细胞被洗掉，但仍留有不少粘附细胞。
②将0.25%胰蛋白酶注入培养瓶内，每瓶1mL（25mL培养瓶），轻轻摇动让胰蛋白酶流过细胞表面，作用1~2分钟后再轻轻摇动1~2次后倒去。
③盖好瓶盖，在普通显微镜下观察，发现基质或肌样细胞由于贴壁较牢固未脱壁，而原先粘附的细胞已浮起，此时再加2mL PBS洗一次倒掉，尽量除去粘附细胞。
④加入含血清的培养基终止消化，再继续用力摇动后倒掉，加入培养基继续培养。隔几日或下次传代前，再进行上述操作，经过几次处理和传代培养后就可将粘附细胞去除，将两者分开，达到使骨髓基质细胞或肌样细胞纯化的目的。
3、机械刮除法
原代培养时,如果上皮细胞和成纤维细胞为分区成片混杂生长，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。可采用机械的方法去除不需要的细胞区域而保留需要的细胞区域。
其方法如下：
(1)将要纯化细胞的培养瓶，在净化室内放在倒置显微镜监视下进行。
(2)用硅橡皮刮子在不需要生长的细胞区域推划，使细胞悬浮在培养液中，注意不要伤及所需细胞。
(3)推划后用培养液冲洗振摇两次倒掉，即可将培养基加入原瓶继续培养。
(4)数日后如发现不需要的细胞又长出，可再进行上述操作，这样反复多次可以纯化细胞。操作过程中要严格无菌操作，防止污染。
4、反复贴壁法
成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞能在短时间内（大约10~30min）完成附着过程（但不一定完全伸展），而上皮细胞（大部分）在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，利用此差别可以纯化细胞。
其方法如下：
(1)将细胞悬液接种在一个培养瓶内（最好培养液内不含血清，此时上皮细胞贴壁更慢）静置20分钟。
(2)在倒置显微镜下观察，见部分细胞贴壁，稍加摇动也不浮起时，将细胞悬液倒入另一培养瓶中，继续静置培养20min，然后再重复上述操作后，即可将上皮细胞和成纤维细胞分隔开，在第1瓶和第2瓶以成纤维细胞为主，往后几瓶即以上皮细胞为主，下次传代时再按上述方法处理，就可使两者达到完全分开的目的。
5、电烙筛选法
在贴壁细胞转化时，往往在培养瓶的细胞层中会出现分散的转化灶，转化灶区域细胞密集、排列规则，有明显生长趋势，与周边未能转化的细胞有明显的区域界限，此时即可用机械刮除法去除未转化细胞，也可用电烙筛选法烫死未转化细胞而保留转化灶细胞。
其方法如下：
(1)倒去旧液，并用记号笔划出转化灶的区域。
(2)用加热的微型电烙器(类似焊接用的电烙铁)将转化灶周边的细胞全部烫死，只保留转化灶细胞。在单细胞克隆筛选时，也可用此法将单个细胞周围的细胞杀死，然后在适应性培养基中（50%是旧液）继续培养，即可达到纯化的目的。
二、细胞的克隆化
细胞克隆技术又称单个细胞分离培养技术，即从细胞群体中分离出一个细胞，并使其在体外培养体系中能繁殖成新的细胞群体，这种由单个细胞所形成的细胞群（或集落）称为一个克隆，这种纯化后的细胞群体称为细胞株。它们当中每个细胞的遗传特征和生物学特性极为相似和一致，有利于对不同群体细胞的形态和功能进行比较和研究。若该细胞株只是一般传代、无一系列实验鉴定指标，则为一般细胞株。若有一系列实验指标报道的，则称为限定性细胞株，如由幼地鼠肾细胞系（BHK21）第13孔的单个细胞形成的细胞株称BHK-21C-13（代表克隆13），其形态规则，特性稳定，便于研究。
单一细胞体外培养能否生长繁殖最后形成克隆，这与各细胞克隆形成率有关，如果细胞克隆形成率偏低（小于10%）应采用一些措施，如改用胎牛血清，适应性培养基添加刺激因子（如胰岛素、地塞米松、细胞生长因子等），调节CO2浓度以控制pH。若贴壁效果差可选用适当的适应性底物（如胶原层或血浆纤维蛋白层），以及制备底层的饲养细胞。用X线或60Co照射处理的细胞层，如鸡胚细胞、骨髓基质细胞，该细胞照光后只有代谢功能，无增殖和传代能力，或选用短寿的细胞，常选用鼠腹水巨噬细胞作饲养细胞，用于单克隆抗体杂交瘤细胞的克隆化。
具体克隆方法如下：
1.毛细管法：
将一定量的细胞悬液（如105/mL或更低）稀释至1个细胞/mL，取10mL稀释的细胞悬液，用直径为0.5mm，长为8mm的毛细玻璃管若干（30～50只），在负压作用下，使悬液吸入各毛细管中，在倒镜下检查出每管只进入一个细胞的毛细管，然后放入适应性培养基或有饲养层细胞的培养瓶（或培养板）内，在CO2培养箱中培养，由一个细胞在毛细管繁殖后，并向管外扩展，并形成单个克隆的细胞群体。
2.有限稀释法
有限稀释法采用梯变倍数稀释的原则，将稀释的细胞悬液接种于微孔培养板中（也可在板上的96孔中直接稀释）培养一定时间后，孔中可出现单个细胞克隆，本法不需特殊设备，操作简单快速，适合大批量克隆化培养。现已广泛用于异质性细胞系的克隆化培养、诱导和分离耐药性或高转移性、或突变细胞株以及单克隆抗体杂交瘤细胞株的克隆筛选中。
具体方法如下：
（1）取对数生长期的细胞制成悬液(贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制成)，经台盼蓝染色计数，测定活细胞数及浓度（细胞存活率及单个细胞百分率应高于90%以上）。
（2）将细胞悬液在试管中稀释，用培养基将细胞稀释至50个细胞/mL、10个细胞/mL、5个细胞/mL，将3种稀释度的细胞分别接种于96孔板中，每孔为0.1mL，于37℃ 5%CO2下培养。
（3）次日在倒置显微镜下观察培养板各孔中的细胞数，挑选只含一个细胞的孔，做好标记并补加0.1mL培养液继续培养。
（4）培养期间，视pH值的变化决定是否换液或补加培养液，一周左右，孔中有明显克隆出现，待长至孔底面的1/3～1/2时，可用消化法将96孔中的单一克隆的细胞分别移至24孔板中进行扩大培养。
3.平皿克隆分离法
在平皿内将单个细胞形成克隆并进行分离培养的方法如下：
(1)将对数生长期细胞制备单个细胞悬液（悬浮细胞用吸管吹打分散，贴壁细胞先用0.25%胰蛋白酶消化后，再用培养基吹打分散）计数并用培养基调整细胞浓度，使5mL培养液内含有50～200个细胞（细胞存活率及单个细胞百分率应大于90%以上）。
(2)将上述细胞悬液迅速移入60mm平皿中，在37℃ 5% CO2下培养1周或更长。若有明显的克隆形成时方可进行克隆分离，方法有两种：
①套环法：在倒置显微镜下观察克隆形成的情况， 标记单个克隆周边，吸干培养基，用涂有少量无菌硅脂的无菌金属套环，套住标记的克隆，在套环内滴加少量0.25%胰蛋白酶，待细胞脱离时，用注射器针头轻轻吹打分散后，转入小平皿或24孔板或6孔板中扩大培养。
②玻片法：在接种细胞悬液前，预先在60mm平皿中放入无菌小玻片，加入细胞悬液，培养一定时间后，在倒置显微镜下标记上含一个克隆的玻片，然后用无菌镊子取出标记玻片转入24孔培养板中继续培养。
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