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各类上皮细胞培养-2

2019.4.26
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zhaochenxu

致力于为分析测试行业奉献终身

6)毛细血管内皮细胞培养 

肿瘤条件培养基制备: 

1.取C3H 小鼠的S-180 实体肉瘤组织。 

2.胰蛋白酶消化,Dulbecco 改良Eagle 氏培养液15ml(含10%小牛血清),接种到T-75 Falcon 产培养瓶中培养。 

3.在细胞生长接近完全汇合时,收集培养液制成条件培养基;再用含10%小牛血清的新培养液后,也每隔两天收集一次,可获得多量条件培养基。 

4.4000 转/分离心后,再通过0.22μm 微孔滤膜滤过,-20℃冻存备用(临用前融解)。 

初代培养: 

1.取材:取新鲜牛肾上腺数个,先用Hanks 液洗除血污。 

2.剥除被膜,分离出皮质,切成1 立方毫米小块,加0.5%胶原酶室温中消化1 小时,每隔10 分钟用吸管吹打悬液令消化充分。 

3.通过不锈钢纱网滤过,网眼要求只允许能通过小于110 微米长的毛细血管小段。 

4.650rpm,4℃,离心7 分钟后,弃掉上清胶原酶。 

5.沉淀物用培养液重悬并离心,再重悬,再离心,共两次。 

6.末次沉淀物仍用含有10%小牛血清的Dulbecco 改良Eagle 氏培养液重悬后,稍吹打。 

7.接种于铺有明胶底层的培养皿中,37℃培养,在培养头1~3 小时中,毛细血管小段和内皮细胞最先帖附于底物上,而肾上腺细胞和成纤维细胞却仍在培养液中漂浮。 

8.趁此时,吸除培养液,再加入肿瘤条件培养液,每两天换液一次。毛细血管小段一般成自1~4 个内皮细胞,以后每个小段在底物上慢慢展成特殊形态的细胞岛,能持续2~5 天。 

毛细血管内皮细胞分离培养: 

1.初代培养2~3 天后,镜下确认几个毛细血管内皮细胞岛,在培养皿背面,用不脱色笔划圈圈起。 

2.镜下检查,如圈内残有非内皮细胞时,可用显微细针在倒置显微镜下挑除。此操作用细胞解剖器或用手操作均可,宜在净化台无菌气流中、打开培养皿盖进行,但时间不宜过长(15~20 分钟),圈内非内皮细胞可用无菌胶刮除。 

3.用培养液漂洗两次,以去除漂浮细胞。 

4.剩余内皮细胞岛如小(5~20 个细胞)而少时,生长增值变得缓慢或不完全不生长,此时需加入3T3 等饲细胞,饲细胞接种量为4000 细胞/cm2。 

5.当内皮细胞充满所有饲细胞空间后,用胰蛋白酶消化、离心、加入肿瘤条件培养基。 

6.接种入明胶底物皿中继续培养(饲细胞死亡淘汰),细胞增殖生长汇合后,按1:5 传代。

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