原位末端转移酶标记技术检测凋亡

（一）原理

凋亡细胞是由于内源性核酸内切酶的激活后，将DNA切割成许多双链DNA片段以及高分子量DNA单链断裂点（缺口），暴露出大量3-羟基末端，如用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）将标记的dUTP进行缺口末端标记，则可原位特异地显示出凋亡细胞。主要应用的是荧光标记法和酶标记法。

（二）荧光标记法

1．材料与试剂 采用德国Boehringer-Mannheim公司In Situ Cell Death Detection 试剂盒，或美国Oncor公司ApopTag^TM试剂盒，包括：

⑴生物素标记的-Dutp(Biotin-dUTP)或地高辛标记的-dUTP(Digoxingeningll-dUTP)１nmol/µl

⑵ TdT酶（25U/μl）

⑶ 反应缓冲液

⑷ 洗涤缓冲液

⑸ 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的亲合素或链霉亲合素（2.5µg/ml）或抗地高辛抗体（1︰30）

⑹ PI染液（含PI 5µg/ml及无DNA酶活性的RNA酶0.1%）

⑺ PBS缓冲液

⑻ 塑料盖玻片

2.样品

⑴ 悬浮生长培养细胞的甩片或涂片

⑵ 贴壁生长的培养细胞

⑶ 冰冻切片

⑷ 常规石蜡切片

3.操作方法

（1）固定：培养细胞的制片或冰冻切片用4%多聚甲醛固定30min(4℃)后，用80%酒精再固定2h（-20℃）。常规4%中性福尔马林固定、石蜡包埋之切片进行脱蜡、水化。

（2）洗涤：玻片浸入PBS缓冲液，摇床上洗涤5min,三次。

（3）反应：洗涤后的玻片用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，按50μl/㎝²滴加反应液（每50μl反应液含TdT酶0.5μl,标记的-dUTP 1μl）,使反应液均匀地覆盖于所有细胞或组织切片上,盖上塑料盖玻片,置湿盒中,37℃孵育1h。

（4）终止反应：去掉塑料盖玻片，将玻片置盛有洗涤缓冲液的染色缸内，洗涤两次，每次5min。

（5）FITC标记：洗涤后的玻片用吸水纸吸去细胞或组织周围水分，按50μl/㎝²滴加FITC反应液（含FITC 2.5μg/ml），室温下避光孵育10min。

（6）洗涤：将玻片置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5min。

（7）PI复染：将玻片置于盛有PI染液的染色缸内，室温下避光染色30min。

（8）封片：用盖玻片直接盖在含PI染液的玻片上，亦可用无色指甲油涂于盖玻片四周边缘，置暗盒中，尽早镜检观察。

4.结果判定：用荧光显微镜观察，选用蓝色激发光（波长488nm），所有的细胞核均被PI着色，显示出红色荧光，而凋亡细胞被特异地标记上FITC，显示出黄绿色荧光。

(三)酶标记法

1.材料与试剂 采用美国Oncor公司ApopTag^TM-Peroxidase试剂盒，包括：

⑴ 过氧化物酶标记的抗地高辛抗体

⑵ 反应缓冲液

⑶ TdT酶

⑷ 反应终止/洗涤液

⑸ 平衡缓冲液

⑹ 蛋白酶K消化液：20μg/ml蛋白酶K溶于PBS。

⑺ 30% H₂O₂

⑻ DAB显色液：0.05%的diaminobenzidine(DAB)溶于PBS，用前过滤并加入

0.02% H₂O₂。

⑼ 甲基绿染液：0.5%甲基绿溶于0.1Mol/L枸橼酸钠，pH调整到4.0。

⑽ 塑料盖玻片及玻璃盖玻片

2．样品 同荧光标记法。

3．操作方法

⑴ 固定：同荧光标记法。

⑵ 内源性过氧化物封闭 玻片置于盛有0.5% H₂O₂缓冲溶液的染色缸内，室温下作用20min后，同荧光标记法洗涤。

⑶ 消化：玻片浸于盛有蛋白酶K消化液的染色缸，室温下消化15min，洗涤

同上。

⑷ 平衡处理：将细胞或组织周围液体用吸水纸吸干，滴加平衡缓冲液（按70µl／cm²）覆盖细胞或组织表面，盖上塑料盖玻片，室温下作用5min～10min。

⑸ 反应：移去盖玻片，倾去平衡液，用吸水纸吸干周围液体，滴加反应液（按50µl/㎝²，18μl TdT酶 36μl反应缓冲液），均匀覆盖在细胞或组织上，盖上塑料盖玻片，置于湿盒中，37℃温育1h。

⑹ 终止反应：移去盖玻片，将玻片置于盛有终止/洗涤液的染色缸内，37℃下洗涤30min（置摇床上振摇）。然后将玻片置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5min。

⑺ 地高辛抗体反应：用吸水纸吸干细胞或组织周围液体，滴加70μl过氧化物酶标记的地高辛抗体，均匀覆盖，加上塑料盖玻片，室温下置于湿盒中，孵育30min。

⑻ 洗涤：置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5min。

⑼ 用吸水纸吸干细胞或组织周围液体，滴加新鲜配制的DAB显色液，均匀覆盖，加上塑料盖玻片，室温下作用3min～6min。

⑽ 洗涤：置于蒸馏水中洗涤3次，每次3min～6min。

⑾ 套染：将玻片置于盛有甲基绿染液的染色缸中，室温染色10min。

⑿ 洗涤：蒸馏水洗涤3次（置于摇床上），每次2min。

⒀ 脱水、封片：100%正丁醇，3次，每次2min。二甲苯，3次，每次2min。

明胶甘油封片。

4．结果判定 光学显微镜下观察，所有的细胞核均着绿色，凋亡的细胞核染色质显示出特异性的棕黄色。