血清LDL－C自动化分析方法的研究进展

  关于 lDL－C的测定方法，目前常用的有聚乙烯硫酸盐化学沉淀法（ pVS法）、肝素柠檬酸纳化学沉淀法（ hCS法）和 friedewald公式计算法（ f公式法），另外还有 nCEP推荐的参考方法即超速离心─化学沉淀法（ bQ法）和琼脂糖电泳染色法。上述方法中，选择性沉淀法需预先沉淀分离，其中 pVS法在 tG＞4g/L时，结果明显偏低， hCS法的准确性依靠于精确的 pH（5 11），F公式法在 tG＞4g／ l时，估算值准确性差，且需要总胆固醇、 tG和 hDL－C的准确测定值，影响因素较多，而超速离心─化学沉淀法（ bQ法）和琼脂糖电泳染色法既麻烦又费时，不适合临床实验室。近年来随着自动化分析仪的日益普及，研制开发适用于自动化分析的 lDL－C直接（ direct）测定法已是当务之急，本文就 lDL－C的自动化分析方法的研究进展作一综述。     1免疫分离法

1995年 mcnamara jR等利用 sigma公司提供的由 genzyme公司发明的 direct LDLTM试剂盒直接测定血清中的 lDL－C，该法是通过使用包被有高亲和力的羊抗人 apoAI和 apoE多克隆抗体的聚笨乙烯胶乳，用一种特制的具有离心过滤装置的双层试管，当一定量的血清和已包被有抗体的聚苯乙烯胶乳悬液被加入到双层离心试管中，使 apoAI和 apoE抗体与血清中的 cM、 vLDL、 lDL和 hDL发生作用，然后1500g离心5min，免疫沉淀的 cM、 vLDL、 iDL和 hDL被过滤装置截留在内层小试管内，含有 lDL的滤液被外层试管回收，通过酶法测定滤液中胆固醇的浓度，即可得出 lDL－C的含量， mcnamara JR等对该法的研究结果表明：分别用本法（ y）和超速离心法（ x）测定115例禁食、非禁食脂代谢异常的患者血清标本，，两种方法相关性良好， y＝08x 0182，r＝097，n＝115。本法批内 cV为12%～38%，批间 cV为20%～51%。用本法可以测定随机非禁食标本和中高度 tG水平标本，且准确度能达到 cDC所要求的 lDL－C准确度≤±5%的标准，表明免疫分离法是一种简便准确的 lDL－C直接测定方法，但该法仅适用于新鲜血清标本，冰冻标本随冰冻时间的延长而产生逐步增加的负偏差。1997年， maitra a等对 lDL－C直接测定法（ d－LDL）也进行了较系统的研究，他们对156名正常人和高 tG患者，分别用 l－LDL、 d－LDL和参考方法 bQ－LDL超速离心─化学沉淀法，三种方法进行 lDL－C水平的测定，其中 d－LDL法即免疫分离法（试剂盒由 sigma公司提供）， l－LDL法是由 poly－medco提出的一种选择性化学沉淀法。结果表明：以国际公认金标准 bQ－LDL法为参考方法，在 tG＜4g/L时，三种方法间呈现良好的相关： l－LDL＝11BQ 003， r＝095， x＝132mmol/L， y＝146mmol/L， sy/x＝014， n＝106； dLDL＝098BQ－001， r＝097， x＝132mmol/L， y＝129mmol/L， sy/x＝01， n＝106；在 nbstG≥4g／ l时，三种方法同样相关良好： l－LDL＝097BQ 037， r＝091， x＝123mmol/L， y＝156mmol/L， sy/x＝018， n＝50； l－LDL和 dLDL法对 bQ－LDL法的平均偏差分别为127%和62%。三种方法在测定禁食和非禁食标本时，结果无显著差别，于1995年 jialal i等的研究结果相近。提示： dLDL法比 l－LDL法更具有优越性，是常规测定 lDL－C的较好的方法，该法也适用于高脂血症儿童标本的分析。 

   2比浊法

1983年， burtl等【11】设计的固定时间动态化学比浊快速测定法，用肝素、 ca2 、 eDTA特异性地沉淀 lDL而产生浊度，以脂肪酶法去除 vLDL干扰。该法主要是测定 lDL总体颗粒而不是 lDL－C，但可用已知 lDL－C值的参考血清的浊度计算出标本中 lDL－C的浓度，其结果同 f公式间接计算法或 lRC超速离心法相关良好。1997年岳秀玲【12】报道利用免疫比浊法测定血清中 lDL－C，其测定原理是血清中 lDL抗原与试剂中羊抗人 lDL抗体作用，形成抗原抗体复合物，并产生浊度，该浊度的高低在过量抗体存在时，与抗原（ lDL）的含量成正比，同时，由于反应液中含有稳定剂可使非 ag－Ab复合物（如脂类、大分子蛋白多聚物等）消浊，而消除非特异性干扰，用已知 lDL－C值的参考血清的浊度计算出待测标本中 lDL－C的浓度。结果表明：本法批内 cV＝26％，批间 cV＝55％，与 pVS选择性沉淀法比较两法相关良好， r＝086。但本法结果较 pVS法明显偏低， p＜005。试法简便、快速，既适用于手工操作，更适合于全自动生化分析仪。但 kerscher等【13】指出测定完整的 lDL颗粒还不能像 lDL－C那样做为一个明确参数，以 lDL颗粒的量估计 lDL－C可能受到 lDL颗粒中胆固醇含量个体差异的影响。 

    3选择性测定法

日本第一化学药品株试会社推出 lDL－C直接测定试剂盒，该试剂盒为液体双试剂盒，适用于各类自动生化分析仪，在无需标本预处理的情况下，实现 lDL－C自动化分析。该法原理【14】是试剂1中的表面活性剂可使样品中的 hDL、 vLDL和 cM颗粒解离，胆固醇分子被释放出来，立即同胆固醇酶试剂反应，产生的 h2O2在缺乏偶联剂时被消耗而不显色，此时 lDL颗粒仍是完整的，加入试剂2（含另一种表面活性剂和偶联剂），它可使 lDL颗粒解离释放出胆固醇，在胆固醇酶试剂的作用下，产生 h2O2，参与 trinder反应而显色，色泽的深浅与 lDL－C的含量成正比，通过与相应的标准品（ lDL－C的校正物）比较，计算出样品中 lDL－C的含量。本法的分析不精密度＜5％，符合 nCEP的要求，因简便、快速、准确，适用于自动化分析，是一种很有发展前途的 lDL－C直接测定法。

小结：上述三种方法中，免疫分离法尽管称为直接测定法，但仍需将血清用连接有抗体的聚苯乙烯胶乳免疫分离预处理过程，且本试剂价格昂贵，免疫比浊法，简便、快速、成本低，适用于自动化生化分析仪。选择性测定法简便快速、微量准确，可适用于具有双试剂加样功能的各类自动化分析仪，是比较理想的 lDL－C自动生化分析方法，但目前尚无国产试剂，由于进口试剂价格昂贵，限制了本法在国内的广泛应用。 
 参考文献

1 Assman g，Jabs Hu， Kohnertu， et al， Clin Chem Acta ，1984;140：77－83

2 Wielland h， Seidel DJ Lipid Res，1983;24：904－909

3 Friedewald wT， Levu ，RI， Fredrickson DS Clin Chem ，1972;18：499－502

4 Bachoric pS， Ross JW， Clin Chem，1995;41：1414－1420

5 Marz w， Siekmeler R， Scharnagl H et al， Clin Chem ，1993;39：2276－2281

6 Schectman g， Patsches M， Sasse EA Clin Chem，1996;42：732

7 Mcnmara jR， Cole TG， Contois JH， et al ，Clin Chem，1995;41：232－240

8 Maitra a， Hirany SV， Jialal I， Clin Chem ，1997;43：1040－1047

9 Jialal i， Hirany， SV， Devaraj S， et al， Am J Clin pathol ，1995;104：76－81

10 Harris n， Neufeld ，EJ， Newburger JW， et al， Chin Chem ，1996;42：1182－1188

11 Demacker pN， Hijmans AG， Breminkmeijer BJ， et al， Clin Chem，1984;30：1797－1800

12岳秀玲，杜洪涛，吴希云。陕西医学检验，1997；12（2）：11

13 Kerscher l， Schiefer S， Draeger B， et al， Clin Biochem ，1995;18：118－225

14日本第一化学药品株式会社说明书