酶联免疫吸附试验 (以下简称ELISA) ：是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原-抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。
根据ELISA所用的固相载体而区分为三大类型：一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA，即我们通常所指的ELISA（微量板ELISA）；另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA,称为斑点ELISA（Dot-ELISA）;再一类是采用疏水性聚脂布作为载体的ELISA，称为布ELISA（C-ELISA）。在微量板ELISA中，又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA。
1、间接ELISA
本法主要用于检测抗体。以鸭病毒性肝炎（DVH）抗体的ELISA为例，间接ELISA的操作程序如下：
(1) 材料
① 包被液、洗涤液、保温液、底物液、终止液；
② DVH包被抗原、酶标抗抗体、阴性及阳性DVH参考血清；待检鸭血清；
③ ELISA检测仪、加样器、聚苯乙烯微量板。
(2) 方法步骤
① 加抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 加待检血清 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干
③ 加酶标抗体 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干
④ 加底物液 → 37℃ 30分钟，加终止液
⑤ 用ELISA检测仪测定OD值，并计算出P/N比值。
(3) 结果判定 已知阳性血清与已知阴性血清的比值（P/N）≥2.1，而且已知阳性血清的OD值≥0.4；在上述条件成立的情况下，如果待检血清与已知阴性血清的比值（P/N）≥2.1，而且待检血清的OD值≥0.4，则判为阳性，否则判为阴性。
2、双抗体夹心ELISA
本法主要用于检测大分子抗原。现以检测鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）的双夹心抗体ELISA为例介绍本法的操作程序。
① 加抗体包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 加待检抗原 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干
③ 加酶标抗体 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干
④ 加底物液 → 37℃ 15分钟，加终止液
⑤ 用ELISA检测仪测定OD值。
3、双夹心ELISA
此法与双抗体夹心ELISA的主要区别在于：它是采用酶标抗抗体检查多种大分子抗原，它不仅不必标记每一种抗体，还可提高试验的敏感性。
此法的基本程序为：
① 加抗体（Ab-1）包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 加待检抗原（Ag） → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
③ 加用非同种动物生产的特异性抗体（Ab-2）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
④ 加入酶标抗Ab-2抗体（AB-3）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
⑤ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液
⑥ 用ELISA检测仪测定OD值。
4、竞争ELISA
此法主要用于测定小分子抗原及半抗原，其原理类似于放射免疫测定。
其基本程序为：
① 抗体包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 加入待检抗原及一定量的酶标抗原（对照孔仅加酶标抗原）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
③ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液
④ 用ELISA检测仪测定OD值。
被结合的酶标抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定，如果待检溶液中抗原越多，被结合的标记抗原的量就越少，有色产物就减少，这样根据有色产物的变化就可求出未知抗原的量。此法的优点在于快速、特异性高、且可用于小分子抗原及半抗原的检测；其主要不足在于每种抗原都要进行酶标记，而且因为抗原的结构不同，还需应用不同的结合方法。此外，试验中应用酶标抗原的量较多。5、阻断ELISA
本法主要用于检测型特异性抗体。该方法现已成为猪传染性胃肠炎（TGE）、猪伪狂犬病（PR）及猪胸膜肺炎（AP）的主要检测方法。
下面以AP2型抗体的阻断ELISA检测法为例介绍其操作程序：
① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 用200μl阻断缓冲液进行封闭 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
③ 加工作量1:4稀释被检猪血清100μl → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
④ 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干
⑤ 加100μl工作量猪抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液
⑦ 用ELISA检测仪测定OD值。
本试验同时设标准阴、阳性血清对照、兔抗AP2型阳性对照、空白对照。
6、抗体捕捉ELISA
本法主要用于检测IgM抗体。由于IgM抗体出现于感染早期，所以检测出IgM，则可作为某种疾病的早期诊断。抗体捕捉ELISA根据所用标记方式不同可分为标记抗原、标记抗体、标记抗抗体捕捉ELISA等几种，其中以标记抗原捕捉ELISA比较有代表性，该方法的主要程序为：
① 用抗u链（抗IgM重链）抗体包被→37℃ 60分钟后置4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 加待检血清 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干
③ 加酶标抗原 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
④ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液
⑤ 用ELISA检测仪测定OD值。
7、斑点ELISA（Dot-ELISA）
与常规的微量板ELISA比较，Dot-ELISA具有简便、节省抗原等优点，而且结果可长期保存；但其也有不足，主要是在结果判定上比较主观，特异性不够高等。该方法的主要操作程序为：
(1) 载体膜的预处理及抗原包被
取硝酸纤维素膜用蒸馏水浸泡后，稍加干燥进行压圈。将阴性、阳性抗原及被检测抗原适度稀释后加入圈中，置37℃使硝酸纤维素膜彻底干燥。每张7cm×2.3cm的膜一般可点加40-53个样品，每个压圈可加抗原液1-20μl。
(2) 封闭
将硝酸纤维素膜置于封闭液中，37℃感作15-30分钟。封闭液多采用含有正常动物血清、pH7.2或pH7.4的PBS。
(3) 加被检血清
可直接在抗原圈上加，也可剪下抗原圈、置于微量板孔中，再加入一定量适度稀释的待检血清，37℃反应一定时间，用洗涤液洗三次，每次1－3分钟。洗涤液一般为一定浓度的PBS-Tween溶液。
(4) 加酶标抗体，37℃反应一定时间后，用洗涤液洗三次。
(5) 显色
加入新鲜配制的底物液，37℃反应一定时间后，去掉底物液，加蒸馏水洗涤终止反应。
(6) 结果判定
以阳性、阴险血清作为对照，膜片中央出现深棕红色斑点者为阳性反应，否则为阴性反应。
8、布ELISA（C-ELISA）
C-ELISA（Cloth-ELISA）是加拿大学者Blais, B. W.等于1989年建立的一种新型免疫检测技术。该方法是以疏水性聚脂布（Hydrophobic Polyester Cloth）即涤纶布为固相载体，这种大孔径的疏水布具有吸附样品量大，可为免疫反应提供较大的表面积，提高反应的敏感性，且容易洗涤，不需特殊仪器等优点。其基本原理与Dot-ELISA类似，只是载体不同。以对布氏杆菌抗原的检测为例，C－ELISA的主要程序为：
(1) 首先把抗布氏杆菌的血清包被（吸附）在聚脂布上，并经洗涤及封闭；
(2) 加被检样品并于室温下感作30分钟，然后洗5次；
(3) 加酶标记的抗布氏杆菌抗体，于室温下感作30分钟，然后洗涤5次；
(4) 加入底物液显色；
(5) 测定OD值。
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