磷酸化化学计量的确定及磷蛋白形成动力学的测定
l 磷酸化作用化学计量的确定
1．在冰上建立下列反应混合液：
Tris-HCl（50mmol/L；pH8.0）/MgCl2（10mmol/L） 250μl
ATP（10mmol/L） 1μl
纯化的DNA结合蛋白（1mg/ml） 4μl
[γ-32P]ATP（13μCi） 1.3μl
2．将反应液混合物分成125μl的两个部分，记为A部分和B部分。B部分将被用于动力学实验。
3．在6个干净管中各加入20μl A部分溶液，然后各管中依次加入0，0.5，1，2，3和4微单位的蛋白激酶以开始磷酸化测试。室温下反应30分钟。
4．将10μl每一磷酸化测试混合液点在一张50px×50px的Whatman 3MM滤纸上，将该滤纸在10％TCA/1%焦磷酸钠溶液中洗10分钟（每张滤纸用5ml溶液）。更换溶液重复洗两次。用100％乙醇洗滤纸。通过对每张滤纸所发出放射性的计数来确定每个样品中磷蛋白的掺入量。
5．在每个管中加入1.1μl 100％TCA以沉淀管中剩余的10μl磷酸化测试混合液。在冰上放置20分钟，室温下用微型离心机在10 000r/min离心10分钟以收集蛋白质沉淀。先用90％后用100％丙酮洗沉淀。在空气中干燥沉淀5分钟。
6．将样品加到SDS－聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中，在160V下1×电泳缓冲液（10×贮液配制）中电泳40分钟。用Saran®膜包裹湿胶，对X光片曝光3小时左右。
7．以放射自显影胶片为模板，切下与DNA结合蛋白相对应的被标记的条带。用5倍体积30％过氧化氢在37℃处理凝胶条带6～12小时以溶解DNA结合蛋白。通过对每个样品的契仑科夫放射的计数来确定磷蛋白的掺入量。
8．用以下两种方法测定待测液中的总掺入量：
a． 将9μl分析缓冲液（50mmol/L Tris-HCl pH8.0/10mmol/L MgCl2）加到1μl A部分溶液中，将混合液点在一张50px×50px的Whatman 3MM滤纸上。不要用TCA处理滤纸。对滤纸所发出的放射性进行计数。
b．将1μl A部分溶液加到适当体积的30％过氧化氢溶液中，并对契仑科夫放射性进行计数。
9．计算掺入到蛋白质中的磷酸的莫尔数。在本实验中，每个分析包含800 pmol ATP和8 pmol（0.3μg）蛋白（如果待测DNA结合蛋白是GBF1的话，其分子量为37 000）。1％掺入蛋白中的放射性相当于每莫尔蛋白含有1摩尔磷酸。
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l 磷蛋白形成动力学的测定
1．向B部分中加入18微单位蛋白激酶并在室温下放置。在第0，5，10，20，25和30分钟时各取20μl试样。取出后立即终止磷酸化反应，取其中10μl点在一张50px×50px的Whatman 3MM滤纸上，并用TCA处理，剩余10μl用1.1μl 100％TCA沉淀。
2．来自B部分样品的处理方法与A部分相同。
3．确定磷蛋白形成的速率。
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l 变性SDS－聚丙烯酰胺凝胶的制备
磷酸化反应洗滤纸时是制胶的良机。
1．依次混合下列组分以配制10％丙稀酰胺分离胶溶液：
丙稀酰胺/双丙稀酰胺（30％） 3.38ml
Tris-HCl（1mol/L; pH8.8） 3.80ml
SDS（10％） 0.10ml
加水至10ml。加入50％APS 12μl和TEMED 10μl，重复混匀（这些足以灌制两块207.50000000000003px×185px×1.875px的微型凝胶）。将溶液注入灌胶的平板夹层中使其充满两块平板间空隙的80％，用水覆盖凝胶，静置10分钟使凝胶聚合。吸去水层。
2．依次混合下列组分以配制4％丙稀酰胺浓缩胶溶液：
丙稀酰胺/双丙稀酰胺（30％） 0.27ml
Tris-HCl(1mol/L; pH6.8) 0.25ml
甘油 0.20ml
SDS（10％） 20μl
加水至2ml，再加入50％ APS 2.4μl和TEMED 2μl，并将溶液加到分离胶上至低于矮平板上沿5mm处，插上梳子。该胶可在室温下存放数小时或装在密封的塑料袋中于4℃放置数天备用。
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用放射性标记的磷蛋白和非标记的DNA探针进行迁移率变动分析：磷酸化蛋白与DNA的结合
l 迁移率变动测定
1．将2μl近似饱和磷酸化的DNA结合蛋白加入到110μl未用poly(dI-dC)配制的迁移率变动缓冲液中。
2．取20μl到一个干净管中作为对照（样品1），在剩余92μl中加入poly(dI-dC)至终浓度为0.07μg/μl，并取出4份各20μl的等分试样（样品2～5）。
3．分别在样品2，3和4中加入0，2和10ng非标记的DNA探针，在样品5中加入0.1μg超声处理的鲑精DNA，并将样品1～5于室温放置30分钟。
4．在每个样品中加入5μl非变性上样缓冲液，并将样品加到非变性聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中，以低于100V的电压在1×电泳缓冲液中电泳3小时。用Saran®膜包裹湿胶，对X光片过夜曝光。更好的方法是在Whatman 3MM滤纸上干燥凝胶，加Kodak增感屏对X光片曝光。
l 非变性聚丙烯凝胶的制备
在结合分析反应时倒胶比较合适。
1．依次混合下列组分以配制4％非变性丙稀酰胺凝胶溶液：
丙稀酰胺/双丙稀酰胺（30％） 6.6ml
电泳缓冲液（10×） 5ml
加水至50ml，并加入50％ APS 60μl和TEMED 50μl。
2．充分混匀，将溶液倒入垂直凝胶电泳装置的平板夹层中（362.5px×425px×5px）。本方法不需浓缩胶，因为分离胶具有自浓缩作用。聚合约需10分钟。该胶可浸泡在1×电泳缓冲液中于4℃保存数周备用。
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用非标记的磷酸蛋白和放射性标记的DNA探针进行迁移率变动分析：磷酸化的蛋白与DNA的结合
l DNA结合蛋白的磷酸化作用
1．向100μl磷酸化缓冲液中加入800ng DNA结合蛋白，并将其中10μl转至一个装有1μl 4mmol/L ATP的管中—作为无激酶的对照样品（样品1）；在剩余90μl中加入9微单位蛋白激酶，然后取10μl到一个干净管中—作为无ATP的对照样品（样品2）。
2．将剩余80μl分为4份，每份20μl（样品3～6），并依次向样品3，4，5和6中加入4mmol/L ATP 2μl，4mmol/L GTP 2μl，4mmol/L GTP 2μl和4mmol/L UTP 2μl。
3．在室温下让样品1～6反应20分钟。
4．向样品1和2中加入100mmol/L EDTA 1.5μl，样品3～6中加入100mmol/L EDTA 3μl以终止反应。每个管中EDTA的终浓度约15mmol/L，置样品于冰上。
l 磷酸化对结合动力学的影响
1．将2μl样品3和5（即分别在ATP和CTP存在下DNA结合蛋白被磷酸化）分别加到20μl含有放射性标记的DNA探针的迁移率变动缓冲液中，通过在室温下反应不同的时间来建立一个“交叉开始”时程，反应时间按从向迁移率变动缓冲液中加磷蛋白起到电泳开始时止计算。由于所有样品要在一块胶上平行地进行分析，而本实验不可能让所有反应同时开始然后在合适的时间点处取样――如果不破坏结合复合物结合反应就不能被轻易中止。因此必须在走胶开始前80分钟开始第一对反应，前40分钟开始第2对，前20分钟开始第3对，前10分钟开始第4对，这样就可以获得80，40，20和10分钟时间点的样品。
2．向每个样品中加入5μl非变性加样缓冲液。首先上反应时间最长的样品到凝胶上，这样反应10分钟的样品的反应时间不至延长太多。为了得到0时刻的样品，在冰上向迁移率变动缓冲液中加入磷蛋白样品，混匀，加到凝胶中，立即开始电泳。在1×电极缓冲液中加入磷蛋白样品，混匀，加到凝胶中，立即开始电泳。在1×电极缓冲液中以低于100V的电压电泳3小时。
3．吸干凝胶，对X光片曝光过夜。
l 不同磷酸供体的影响
1．分别将2μl样品1～6（见上文）加入到20μl含有放射性标记的DNA探针的迁移率变动缓冲液中，室温下反应30分钟。
2．向每个样品中加入5μl非变性加样缓冲液，并将样品加到非变性聚丙烯酰胺凝胶上，在1×电极缓冲液以低于100V的电压电泳3小时。
3．吸干凝胶，对X光片曝光过夜。
l 非变性聚丙烯酰胺的制备
1．依次混合下列组分以配制4％非变性丙稀酰胺凝胶溶液：
丙稀酰胺/双丙稀酰胺（30％） 6.6ml
电极缓冲液（10×） 5ml
加水至5ml，并加入50％APS 60μl和TEMED 50μl。
2．充分混合，将溶液注入垂直电泳装置的平板夹层中（362.5px×425px×5px）。本方法不需浓缩胶，因为分离胶具有自浓缩作用。聚合约需10分钟。该胶可浸泡在1×电极缓冲液中于4℃保存数周。
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