血细胞五分类技术及其应用进展

血细胞五分类测定常用技术及五分类技术原理:

血细胞分析仪是医院临床检验应用非常广泛的仪器之一，是指对一定体积内血细胞数量及异质性进行分析的仪器。20世纪9o年代以来，随着电子技术、流式细胞技术、激光技术、电子计算机技术和新荧光化学物质等各种高新技术在血细胞分析仪中的应用.使血细胞分析仪的检测原理不断完善、测量参数不断增加、检测水平不断提高.尤其在白细胞五分类技术方面，已发展到利用多项技术(如射频、细胞化学染色、流式细胞术和荧光染色技术等)联合同时检测一个白细胞.再用先进的计算机技术区分、辨别经上述方法处理后的各自细胞间的细胞差别.综合分析实验数据，得出较为准确的白细胞分类结果。为临床疾病的诊断、治疗提供了重要的实验室依据。近年来。可以对白细胞进行五分类计数的血细胞分析仪已经普遍使用。本文就目前血细胞五分类测定中常用技术及其最新应用进展作一综述。

1 血细胞五分类技术的原理
1.1 流式细胞术
流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种综合应用光学、机械学、流体力学、电子计算机、细胞生物学、分子免疫学等学科技术，使被测溶液流经测量区域，并逐一检测其中每一个细胞的物理和化学特性，从而对高速流动的细胞或亚细胞进行快速定量测定和分析的方法。

首先，待测细胞经处理或染色后被压人流动室，与此同时，不含细胞的缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管人口方向与待测样品流成一定角度，这样鞘液就能被包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在包绕下单行排列，依次通过检测区域.在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。这两个光源信号分别反映了细胞体积的大小和内部的信息.经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模，数转换器.将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，经计算机处理，可将分析结果显示在屏幕上。

为了保证细胞单个排列地逐一通过检测区域，鞘流技术在流式细胞术中被广泛应用。根据层流理论，由于两种液体的流速和压力不同。在一定条件下样品溶液与包裹它的鞘液在流动中可以保持相互分离并且同轴。同时鞘液流可以加速样品溶液中颗粒的流动并迫使他们的流动轨迹保持在液流的中轴线上，使细胞单排列地逐一通过检测区域，这便是所谓的液流聚焦原理

1_2 阻抗法
根据库尔特原理，将不良导体血液按一定比例稀释于等渗的电解液中，在小孔电极的两侧加一恒流源.在负压作用下，使稀释的血细胞通过小孔。当细胞通过截面时会由于电阻增大产生相应的脉冲，其脉冲的幅度与细胞的体积成正比，脉冲的频度与细胞的数量成正比。这便是著名的库尔特原理或称变阻脉冲原理。利用库尔特原理可以有效地区分淋巴及单核细胞。

1.3 激光散射法／多角度偏振光散射技术
根据光散射理论，当激光照射到流动室内流过的每一个细胞时，由于细胞的物理特性，部分光线从细胞上经不同的角度散射。其中，前向小角度散射光的光强可以反应细胞体积；大角度散射光的光强可以反应细胞核，浆复杂度和细胞颗粒的信息；而侧向散射光的光强可以反应细胞膜、核膜、细胞质的变化。因此，可以依据细胞表明光散射的特点对细胞进行分类。www.med126.com用激光光源产生的单色光束直接进入计数池的敏感区，在不同角度(10度～7O度)对每个细胞进行扫描分析，测定其散射光强度，从而提供细胞结构、形态的光散射信息。由于粗颗粒细胞的散射强度比细颗粒细胞更强，故光散射对细胞颗粒的构型和颗粒质量具有很好的区别能力。

多角度偏振散射技术用偏振激光束射照单个排列细胞，并进一步分辨细胞。该技术采用了l0度窄角和偏振加消偏振检测法，分辨能力有所提高。它首先测试中性，单核细胞，用0度～90度的散射数据，再测得90度D的衍射差，将嗜酸性和中性细胞分开.而嗜碱性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞则按其大小和内部结构不同的复杂性，所产生的散射光也各异，用可调较的门限加以区分。其采用特定程序自动储存分析数据，并经计算机软件处理，在屏幕上显示6个散点图和2个直方图。

1.4 各种细胞化学特性应用技术
利用五种白细胞自身不同的化学性质.应用相应的化学试剂加以区分

由于嗜酸性(或嗜碱性)粒细胞均有较强的碱性(或酸性)，因此在特殊的溶血剂作用下，经过特定时间及温度的孵育，可使除嗜酸性(嗜碱性)粒细胞之外的所有细胞溶解或萎缩.经处理之后的细胞根据阻抗脉冲计数法，可得相应嗜酸性(嗜碱性)细胞有效数值。

利用五种白细胞过氧化物酶活性的差异对白细胞进行染色，测定其酶反应强度，对白细胞进行分析。血液中五种白细胞的过氧化物酶活性排列顺序为：嗜酸性粒细胞>中性粒细胞>单核细胞。淋巴细胞和嗜碱性粒细胞均无过氧化物酶。将待测血液加入清洗剂和甲醛的等渗液体内经孵育，再加入过氧化氢和四氯一萘酚，细胞内过氧化酶分解产生氧离子，使四氯一萘酚显色并沉淀，并定位于酶反应部位。根据酶反应强度的不同，利用光电检测技术测定相应吸光度值的方法,用以区分嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞。

1.5 电导，射频法
与早期的三分类血液分析仪利用库尔特原理不同的是，它在内外电极上加了一个RF射频发生器。RF是射频电流的简称.它是一种高频交流变化电磁波。按照工作频率的不同，RF可以分为低频(LF)、高频(HF)、超高频(UHF)和微波等不同种类.不同频段的RF工作原理不同， 和HF频段一般采用电磁耦合原理，而UHF及微波频段的RF一般采用电磁反射原理。在血液分析仪中多采用高频电磁波，其原理是交变电流通过导体时，会在导体周围形成交变电磁场，形成电磁波。因导体的密度及导电性质等差异，其周围所形成的电磁场也不相同。因此当射频电流穿透细胞膜透入胞内时，由于核的大小、化学组分、颗粒多少以及浆核比例的不同，使RF信号发生不同的变化。借此可以将体积大小相同但内部结构不同的细胞区分开来，如淋巴细胞与嗜碱性细胞。

1.6 荧光法
利用不同细胞的细胞膜、胞内因子以及胞内DNA、RNA、胞内离子钙等不同染色特性，选用具有特异性抗原或抗体的荧光染料载体，使待分离的细胞分别标记相应的荧光物质，经过特定波长的激光照射激发出不同波长的荧光，利用各种PMT管检测荧光信号的个数，可以完成待检细胞的计数 如进一步分析计数淋巴细胞或网织红细胞等

2 血细胞五分类技术的应用及展望

2.1 五分类血液分析仪的现状
全自动五分类血细胞分析仪是多学科相互交叉、渗透、综合的产物，涉及技术领域包括电子技术、计算机技术、传感器技术、信号处理技术、生物化学、临床医学、精密机械、光学、自动控制、流体力学等领域。绝大多数“五分类”分析仪采用了流式细胞分析方法，而联合检测法则代表了五分类血细胞分析仪的最新发展趋势。

BECKMAN COULTRER GENS全自动五分类血球分析仪采用其独特的VCS技术，其中V(体积法)用于分析细胞体积；C(电导法)用于分析细胞核型；S(散射法)则用于分析细胞的颗粒特性。测试时。患者标本经过分血片等样本分配系统进入搅拌杯中，再加入溶血剂搅拌.溶血.完全破坏红细胞，剩下的白细胞在样本压力作用下进入流式通道。运用VCS联合检测方法，在流式通道的某一位点。对通过的单列白细胞，进行逐个的、同时的、三重的检测以及三维分析，以确定其亚群性质。

雅培公司新推出的CELL-DYN Ruby全自动血液分析仪运用合并流式细胞术及多角度偏振散射分离技术检测白细胞。其采用多角度偏振散射技术对白细胞进行区分和按序分离，通过四个角度的光学检测进行白细胞分析。其中，0度用于区分细胞体积大小；10度用于区分细胞的复杂性；90度用于区分细胞核的分叶性；90度D用于区分细胞的颗粒性。通过90度偏振和90度去偏振区分嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞， 同时通过多个散点图分析来鉴别和分类未成熟细胞和干扰物质。

拜尔公司的ADV IA120利用化学特性中过氧化物酶活性与激光散射技术结合原理进行白细胞五分类测定。该仪器有4个测量通道：血红蛋白测量通道、红细胞／血小板测量通道、嗜碱性粒细胞测量通道、过氧化物酶测量(白细胞分类)通道。其利用五种白细胞过氧化物酶活性的差异对白细胞进行染色.测定其酶反应强度，对自细胞进行分析。在测试过程中.每个细胞产生2个信号：组化染色结果与光散射结果。www.med126.com以X轴代表吸光率(组化染色酶反应强度)，Y 轴代表光散射(细胞大小)，一起定位于细胞图上(cytogram)。计算机系统对存储资料进行分析处理，并结合嗜碱性或分叶细胞通道结果计算出白细胞总数及分类。值得一提的是，该设备对RBC及PLT的测定也摒弃了传统的阻抗法，而是采用激光法对其进行测定的。

希森美康(SYSMEX)公司五分类血液分析仪的检测原理按生产时间的先后可分为三大类：多通道阻抗与射频联合检测技术.代表机型有SE一9000；激光流式细胞检测结合细胞组化染色技术，代表机型有SF一3000；激光流式细胞检测结合核酸荧光染色技术，代表机型有SF一2l00。

SYSMEX XE一2100全自动血细胞分析仪是综合了前向散光、侧向散光和侧向荧光三种光学检查技术，结合电阻抗技术来进行白细胞分类的。直流电阻抗法(DC)用于测量细胞体积大小。激光散射产生的前向散射光、侧向散射光可用于探测白细胞体积大小、细胞内含物的情况(细胞核以及颗粒情况)，侧向荧光则可以反映细胞内脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的含量。综合各个测量方法，得到白细胞五分类的图形和数据。SYSMEX XT一2000i全自动血液分析仪运用核酸荧光染色技术，配合激光流式分析系统，保证了精确的WBC五项分类结果。

HORIBA ABX 公司生产的Pentra系列五分类血液分析仪采用独有的双鞘流通道，结合阻抗法、化学染色技术及吸光度法对白细胞进行精确的分析。流式通道内有两个检测装置，60um的鞘流微孔用于阻抗法体积检测，42um 的光窗用于吸光度测定分析细胞内容物。实现对大量细胞进行的顺序、快速、准确地分析与测定。

以上所介绍的几种血液分析仪是目前我国医疗机构常见的具有代表性的几种测定白细胞五分类的机型。另外，日本光电公司生产的MEK一8222K在中国的拥有量也较大.因其工作原理与雅培公司的CELL—DYN Ruby相似.也是采用半导体激光法和多角度激光散射技术，只是试剂的配方有所区别，因此不再赘述。

国内迈瑞公司生产的BC一5500的白细胞分类结合了液流聚焦技术、激光散射技术和化学染色技术。其光源采用半导体激光系统，通过多角度的激光散射，提供细胞的大小、细胞核、细胞颗粒大小及复杂性的信息.并结合试剂对嗜酸性细胞和嗜碱性细胞的特异处理，将嗜酸性细胞和嗜碱性细胞区分开来，刚筛选出各类异毒细胞，实现精确的五分类检测结果。

由于不同仪器的检测原理及相关试剂的差异，各类设备均有其相应的特点。总体来讲，光学检测法结合特种化学试剂如染色物质等.由于其针对某一被检物质的特异性，因此其测定及分析结果较电阻法精确度要高，但相应的试剂成本加大，同时对操作人员及环境的要求也会有所提高。

2.2 五分类血液分析仪的展望
从五分类血液分析仪的发展进程可以看出，临床对血细胞的分析已不满足于简单的对WBC、RBC、PLT的计数，而是更倾向对于其各类细胞及其亚群的进一步分析，包括从细胞内部的DNA，RNA及免疫等方面进行分析。冈此，血细胞分析仪已从对细胞的简单的物理性能的研究转向对细胞内部化学性质及免疫性质的研究方向发展，即从细胞学向分子生物学，从分子生物学向免疫学方向发展。同时，随着工业科技的进步，仪器的精度、速度、集成化、一体化的程度会更高，相信在不久的将来会有更先进的血液分析系统面世。