抗体的标记方法

荧光色素标记抗体

1．准备好凝胶滤柱以便完成结合反应后用于分离标记抗体和游离的荧光色素。分离球形蛋白使用排除极限为20 000～50 000的凝胶介质和细粒级凝胶（直径约50μm）。所需凝胶滤柱的大小可根据偶联反应的总体积×20来确定。依据厂家说明准备好滤柱，用20倍柱床体积的PBS灌注滤柱，直至缓冲液水平刚好降至低于柱床顶部，关闭滤纸底部的阀门或用塑膜黏土（或parafilm）封闭底端以使滤柱不再流动。

2．用0.1mol/L的硼酸钠或碳酸钠配制浓度至少为2mg/ml的抗体溶液（pH9.0）。应避免引入含一级胺的外来分子。

3．用无水DMSO（优级纯）溶解FITC或TRITC至1mg/ml。每次标记反应时新鲜配制。

4．每1ml蛋白溶液加50μl染液。染液须以每次5μl缓慢加入，加入时应轻轻地连续搅拌混匀。

5．置4℃避光反应1h。

6．加氯化铵至50mmol/L，室温孵育2h。加入0.1％二甲苯氰和5％甘油。

7．通过凝胶过滤分离结合物与未结合的染料。小心地将偶联反应产物加在滤柱顶部，打开阀门使抗体溶液流过滤柱直至刚好进入柱床。再小心地将PBS加在滤柱顶部并与缓冲液供应装置连接。结合染料的抗体首先洗脱，通常可在室光下见到。

8．将洗脱液的结合物4℃贮存于避光容器，必要时加入0.02％叠氮钠。

9．进行荧光素偶联反应时，应通过测量495nm和280nm波长的吸光值计算荧光素和蛋白的比率，罗丹明的测量波长在550nm和280nm。荧光素的吸光值比例（496nm/280nm）应在0.3～1.0之间，罗丹明的吸光值比率（550nm/280nm）在0.3～0.7之间。低于上述比率将导致低信号，高比率则出现高背景。若比率太低，应使用低浓度抗体与高浓度染料重复结合；若比率太高，则可适当调整后重新标记，或通过DEAE离子交换层析柱进一步纯化抗体。用10mmol/L 磷酸钾（pH8.0）平衡并灌注滤柱，通过增加盐浓度进行梯度洗脱。测量每一组分的吸光值比率（495/280或550/280），选取适当组分合并。

生物素标记抗体

1．用无水DMSO配制10mg/ml生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液。

2．用硼酸盐缓冲液（0.1mol/L, pH8.8）配制浓度至少为1～3mg/ml的抗体溶液，若抗体储存时加入了叠氮钠，则标记前须先在硼酸盐缓冲液中充分透析以除去叠氮钠。

3．按25～100μg/mg的比率将生物素酯加入抗体中，混合均匀并在室温下孵育4h。在完成结合反应之前DMSO的终浓度不能低于5％，否则生物素酯会出现沉淀。高浓度的生物素酯会导致多个生物素分子结合在抗体上，因此可能会使所有抗体都被标记。较低的比率则会是使生物素化保持在最低限度（25μg生物素酯/mg抗体的最初摩尔比为10：1）。

4．每250μg生物素酯内加入20μl 1mol/L的氯化铵，室温孵育10min。

5．将抗体溶液用PBS或其他所需的缓冲液透析，以除去未结合的生物素。由于生物素分子较大，故透析比预料中的要慢，或者用蛋白A或蛋白G层析柱再次纯化抗体。

6．按纯化抗体的储存方法保存标记抗体。

放射性碘标记抗体

1．在碘标记之前，准备氯甘脲包被的试管（2支6mm碱性玻璃管或1.5ml圆锥形试管）。将氯甘脲溶于浓度为0.5μg/ml的氯仿中。再将其分别加至试管中，每管100μl和20μl。让氯仿在通风橱中挥发过夜。室温储存试管于干燥器中，可保存数年。包被有20μl氯甘脲的试管碘化效率较低，如果在平常的碘化反应时引起抗体受损，则可用此试管。

2．在即将开始碘化反应之前，准备好分离标记抗体的凝胶层析柱。使用排阻限度为20 000～50 000供分离球形蛋白分子的凝胶介质。选用中等粒度的凝胶微柱（直径约100μm）。依照说明书准备装有1ml体积凝胶微柱的滤柱，滤柱在标记之后将丢弃，故应选择适合的滤柱。为了使碘化蛋白的非特异性结合减少到最低，滤纸应先用至少10倍体积的含0.02％叠氮钠的1％ BSA/PBS淋洗，然后再用10倍体积的PBS淋洗滤柱以除去BSA。或者用含BSA的缓冲液膨胀凝胶粒，使用前再洗去BSA。让滤柱内缓冲液流出直至刚好低于柱床顶部，关闭凝胶柱底部的阀门或用塑膜黏土塞住胶柱末端。

3．在进行碘化反应之前即时准备“终止”管，用于终止氧化反应及滞留未参与结合反应的剩余碘。于1.5ml锥形试管中加入50μl氯甘脲终止缓冲液（10mg/ml饱和的酪氨酸、10％甘油和含0.1％二甲苯氰醇的PBS）。

4．室温下在通风橱内向氯甘脲包被管中加入50μl抗体。抗体用0.5mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.5）配制，浓度为0.2～1mg/ml。

5．于有抗体的氯甘脲试管中加入500μCi Na，将吸液头丢入专门盛放废弃¹²⁵I材料的容器中。孵育2min，时间可稍延长，但可能会增加抗体的氧化损伤。

6．用巴斯德移液管将试管中液体移至盛有50μl氯甘脲终止缓冲液的试管中，轻轻混合。将巴斯德移液管和氯甘脲包被管丢于放射性废物容器中。

7．小心将终止管中的反应混合物加到滤柱内，并将移液管丢于放射性废物容器中。

8．放开滤柱的阀门，开始收集洗脱液于1.5ml锥形试管中。在碘标记蛋白流入凝胶微珠内后，向滤柱内小心加入0.3ml含0.02％叠氮钠PBS。继续收集洗脱液于第一管中。当缓冲液到达凝胶微珠顶部时，换用第二支锥形试管，然后再向滤柱内加入0.3ml含0.02％叠氮钠的PBS，再收集洗脱液。继续重复上述洗脱步骤。用微型检测仪监测各管中¹²⁵I标记抗体和游离标记物的波峰。抗体应出现在第2～4洗脱组分，明显早于蓝色的二甲苯蓝氰醇，后者与游离标记物一道洗脱。

9．将含有碘化抗体的洗脱组分合并。将未参与结合反应的标记物连同整个滤柱丢于放射性废物容器中。

10．  标记抗体可储存于1％ PBS/BSA洗脱缓冲液中，放4℃保存。虽然抗体比较稳定，但放射性碘并不稳定。因此，标记抗体应在6周内使用。

生物合成法标记单克隆抗体

1．标记时杂交瘤细胞须生长旺盛、快速增殖。离心（3000g，10min）收集大约2×10⁶个细胞。

2．用37℃预温的不含蛋氨酸的培养基重悬细胞，洗涤一次，再离心300g，10min。

3．用不含蛋氨酸的培养基重悬细胞至大约10⁶/ml。加入[³⁵S]蛋氨酸（每次标记用100μCi）可获得放射性强度约为10⁵～10⁶cpm的抗体。

4．于CO₂培养箱中37℃孵育过夜。

5．将细胞悬液以1000g离心10min，得到密集的细胞沉淀。弃去上清液。加入1/20体积的1mol/L Tris(pH8.0)和叠氮钠至0.02％。