三.填空题
1.限制酶是一类专门切割 DNA 的酶,它能特异性识别切割 双 链(单、双)DNA。
2.II型限制酶识别位点一般长度为 4~6 个核苷酸对。
3.个体之间DNA限制酶片段长度存在差异称 限制性片段长度多态性(RFLP)。
4.限制酶命名采用Smith和A thens提议的方案,第一个字母大写取自来源细菌的 属名 ;第二、三个字母取自来源细菌的 种名;第四个字母(如果有)取自来源菌的 株系。
5.需要部分酶切时可采取的方法有(1)减少酶的用量 (2)缩短反应时间 (3)增大反应体积。
6.限制酶识别序列为n个碱基,则其切割频率的理论值应是 4n。
7.限制性内切酶通常保存在 50% 浓度的甘油溶液中。
8.甘油浓度是导致一些酶的星活性的原因之一,在酶切时反应体系中的甘油浓度应控制在 5% 以下。
9.限制与修饰是宿主的一种保护体系,它是通过对外源DNA的 限制 和对自身DNA的 修饰 来实现的。
10.II型限制酶既具有 识别位点 的专一性,也具有 切割位点 的专一性。它作用时需要 Mg2+ 离子作辅助因子。
四.简答题
1.在酶切缓冲液中加入牛血清白蛋白(BSA)的目的与机理是什么?
答:目的是保护酶的活性;机理是通过提高反应体系中蛋白质的浓度,防止内切酶失活。
2.如果用EcoR I酶切DNA时出现星活性,试分析原因?
答:主要原因有:酶浓度太高;高PH;低盐;含Mn2+、Cu2+等非Mg2+金属离子;甘油浓度高于5%;存在某些有机溶剂。
3.下列序列中哪些可能是II类限制酶的识别序列?
ATATCG CCCGGG GATATC AGCCGA GAGTC
答:CCCGGG GATATC GAGTC
4.用Klenow酶可将5‘粘末端填补成平末端,而导致某些限制位点消失,下列酶切后用klenow处理再连接不会丢失识别位点的是哪些?
XmaI C↓CCGGG BssH II G↓CGCGC PstI CTGCA↓G
HhaI GCG↓C HpaII G↓CGC
答:BssH II, HpaII
5.当两种限制酶反应条件不同时,若要用双酶切,应采取什么措施?为什么?
答:要避免星活性及部分酶切。(1)先用低盐缓冲液中活性最高的酶切,再补盐和第二种酶;(2)用一种酶消化后,以酚:氯仿:异戊醇抽提,再经乙醇沉淀,将DNA重新溶解与适合第二种酶的缓冲液,加第二种酶消化;(3)先低温酶,后高温酶;(4)使用通用缓冲液。
6.试计算下列三种限制酶各自在某染色体DNA序列上的切割概率
Sau3A I GATC Pst I CTGCAG Hinf I GANTC
Acy I GPuCGPyC
答: 1/44;1/46;1/44;(1/44)x(1/22)
7.一长为4.2kb的DNA片段,分别用EcoRI、PstI及EcoRI+PstI消化,电泳结果如下图所示,请根据结果绘出该片段限制性图谱
0.7kb
0.7kb 0.8kb
1.5kb 1.4kb 2.0kb
2.0kb 2.8kb
EcoRI Pst I EcoRI + Pst I
答: EcoRI PstI EcoRI
0.7kb 0.7kb 0.8kb 2.0kb