5. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
6. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。
7. 2～8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
8. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2～8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。
9.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5～10分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25～200μl无RNase的水或0.5℅SDS，用枪头吸打几次，55～60℃放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。
注意事项：
1.从少量样品（1～10mg组织或102～104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800mlTRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5～10μgRNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。
2.匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2～8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
3.分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30～60分钟。
预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：
肝和脾6～10μg ，肾3～4μg ，骨骼肌和脑组织1～1.5μg ，胎盘1～4μg ，上皮细胞8～15μg ，成纤维细胞5～7μg 。
常见问题分析：
得率低：
A.样品裂解或匀浆处理不彻底。
B.RNA沉淀未完全溶解。
A260/A280<1.65 ：
A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高。
B.样品匀浆时加的试剂量太少。
C.匀浆样品时未在室温放置5分钟。
D.吸取水相时混入了有机相。
E.RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解：
A.组织取出后没有马上处理或冷冻。
B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃。
C.细胞在用胰酶处理时过度。
D.溶液或离心管未经RNase去除处理。
E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5 。
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