植物基因转化常用方法-3

（三）改良植物性状的策略
　　基因克隆技术提供了一种新的改良植物的方法，它可以直接的改变植物的基因型。有两种策略可以应用。
　　1） 基因附加：通过添加1个或多个基因改变植物的性状。
　　2） 基因扣除：利用基因工程技术使一个或多个植物已经存在的基因失活。
　　灭活植物基因是通过反义技术来实现的。将外源基因反向的连接到载体中，当基因转录成mRNA后，与正常的mRNA是反向互补的。我们称这种反向互补为反义RNA，缩写为asRNA。
　　反义RNA阻止原有基因表达的机理尚不明了，但可以肯定，正义和反义RNA之间的杂交与这一事件有关，可能双链的RNA很快被核酸酶降解 ，或者反义RNA阻止了核糖体与正义RNA的结合。

                     图 11-27 反义技术的原理

1 基因附加的方法

我们以抗虫基因为例来说明。

1.1    理想的杀虫剂

在农业生产中危害最严重的是昆虫。为了减少损失，一般使用杀虫剂。大部分杀虫剂没有选择性，杀灭害虫的同时也消灭了天敌，同时对生物圈中的其他生物产生影响，包括人，污染了环境。有一些生物生长在植物体内，可以避免农药的伤害。

理想的杀虫剂具有的特性:

它必须对害虫有害，但毒性应该有选择性，对其他生物无害。

杀虫剂能够必降解，作物收获后不存在残留，并且对环境无污染。

可以保护整个植株，不单单是地上部，免受害虫危害。

到目前为止，我们还未发现这样的理想杀虫剂，最相近的是来自于苏云金杆菌的δ-内毒素。

a)       苏云金杆菌的δ-内毒素

苏云金杆菌在孢子形成的过程中，细胞内形成杀虫晶体蛋白—称为δ-内毒素，其活性很强，有时要比有机磷毒性高80000倍，而且选择性很强，不同品系的细菌和成不同的毒蛋白。

在细菌中积累的δ-内毒素是无活性的前体，昆虫食用后，前毒素被蛋白酶消化后产生有毒性的蛋白，结合到昆虫肠道内，破坏表皮细胞，使昆虫不能进食，从而饥饿而死。不同昆虫中，晶体结构不同产生了特异性。

苏云金杆菌并不是最近才发现的，早在1904年即开始使用，可以作为无公害的杀虫剂，但他很容易降解，所以要不断的补充，增加了农民的成本。因此研究者试图生产不需要连续补充的δ-内毒素，一种方法是利用蛋白质工程，修饰其蛋白结构使其更加稳定，另一种方法是通过基因工程是植物能够合成自己的毒素。

b) 将δ-内毒素克隆到玉米中

传统杀虫剂在玉米上效果较差，主要害虫是玉米螟，生物技术学家试图获得能合成δ-内毒素的玉米。

北卡莱罗纳Ciba-Geigy实验室使用Cry1A(b)内毒素，这是一个1155个氨基酸的蛋白，29-607位的片段具有毒性。Ciba-Geigy研究小组并没有使用完整的基因，只使用了前648个密码子，人工合成了这一片段，这样可以对原始基因进行修饰，使用玉米偏爱的密码子。原始基因中GC含量是38%, 而人工基因的GC含量为65%。

将人工基因连接到盒式载体上，后接一个来自于CaMV的多腺苷酸化信号，利用微粒轰击法将其引入玉米的胚中。胚胎长成植株后，利用PCR法鉴定。利用人工基因特异的片段作为PCR引物。

下一步工作就是利用免疫技术鉴定转基因植株是否合成了δ-内毒素，结果显示人工基因确实具有活性。不同植株中产生的δ-内毒素数量不同，从250-1750ng/mg总蛋白，这种差异是由位置效应引起的。

                      图11-28  位置效应

转基因植株是否对玉米螟有抗性呢？在田间条差了6个周，应用两条标准来衡量：害虫对植株总的危害，以及虫道的长度。转基因植株表现了较好的抗虫效果，对照虫道长度1017.5000000000001px, 转基因植株虫道只有157.5px。