克隆法
实验方法原理 |
限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段,经DNA的纯化处理后用于连接反应;选择克隆载体pUC18多克隆位点上相应的限制性内切酶切割,并用碱性磷酸酶处理防止载体自连;在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上,实现外源片段的克隆。 |
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实验材料 | DNA片段 PUC18 |
试剂、试剂盒 | R.E buffer 水 凝胶 氯仿 异戊醇 乙醇 |
仪器、耗材 | 离心机 |
实验步骤 |
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注意事项 |
1. DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。 2. 氯仿对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用,它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏,操作时需戴手套、安全镜并在通风橱中进行。苯酚是强腐蚀剂,能引起严重烧伤。操作时应戴手套、安全镜、穿防护服,并在通风橱中进行。
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其他 |
1. 克隆中所用到的几种酶:(1)限制性内切酶(2)碱性磷酸酶(3)连接酶(体外催化磷酸二酯键的形成可使用两种酶:大肠杆菌连接酶和T4噬菌体连接酶),但几乎在所有的克隆中T4噬菌体连接酶都是首选的酶,因其能在正常的反应条件下能有效的将平端连接起来。 2. 载体的负载能力:即能克隆多大的DNA片段,是否有合适的限制性内切酶位点,酶切位点的性质,粘性或平末端,是否有选择重组克隆的其它标记,如蓝白斑筛选等。
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