实验步骤 |
材料
缓冲液和溶液
参照附录 1 配制贮存液、缓冲液、试剂。稀释贮存液到适当的浓度。
丙烯酰胺溶液(45%m/V) 丙烯酰胺(DNA 测序级) 434 g N,N'-亚甲双丙烯酰胺 16 g 加水 至 600 ml
加热至
37°C 以促进溶解用蒸馏水调至 1 升,用硝酸纤维素膜过滤(孔径 0.45ptn).
室温贮存于棕色瓶中。另外一种较为昂贵的方法是购买预先混合好的丙烯酰胺: 双丙烯酰胺粉末,再用水溶解。便宜的丙烯酰胺:
双丙烯酰胺粉末通常混合有金属离子。由此配置的贮存液需要纯化,方法是,与 0.2体积的树脂(MB-1,Mallinckrodt) 混合搅拌,再用
Whatmenl 号纸过滤。贮存中,丙烯酰胺: 双丙烯酰胺会缓慢的变成酸性,这个脱氮基过程由光和碱催化。保持溶液 pH 值在7.0
或者以下,在黑色瓶中保存于室温应该每几周重配一次。
过硫酸铵水溶液(1.6%m/V)
去离子水
去污剂
乙醇
KOH/甲醇溶液 在 100ml 甲醇中加入 5 gK0 H 配成,用于清洗玻璃板,贮存在密闭的玻璃瓶中。
聚硅氧烷溶液 传统的聚硅氧烷溶液中包括二氯二甲基硅,它有毒性、挥发性并且易燃。近年来,出现了一些无毒的替代物,包括
Gel Slick(FMC Bioproducts)、RainX(Unelko,Scottsdale Arizona), 和
Acrylease(Stratagene)。
10XTBE 电泳缓冲液 TBE 在聚丙烯酰胺凝胶电泳时的浓度是 lx(89
mmol/L Tris-硼酸,2 mmol/L EDTA),这一浓度是琼脂糖电泳用量的 2 倍(请见第 5
章)。用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的垂直电泳槽的缓冲液池一般较小,故所通过的电流量通常相当大。要用 lxTBE 才能够保证适当的缓冲容量。缓冲液的
pH 值应接近8.3。一般无须调 pH 值;可是,对于每次新配的 10XTBE 电泳缓冲液都要认真检査 pH 值。 使用同样的 10xTBE 电泳缓冲液配制胶和工作缓冲液,因为两者之间微小的差异也会导致 DNA迁移时严重扭曲。 使用氨基乙磺酸(36
g/L 的 10XTTE 缓冲液) 取代标准 TBE
溶液中的硼酸可以减少由于形成甘油-硼酸阴离子脂类化合物而导致的在胶的顶部的条带扭曲<Pisa-Willanson and
Fuller1992)。若需要更多的信息请参见 DNA 测序反应中的甘油一节。
TEMED(N,N,N',N'-四甲基乙二胺) 电泳级的 TEMED 在很多公司有售(Sigma,Bio-Rad),TEMED 容易吸潮,必须 4°C 贮存在密闭的瓶中。它是聚合反应中的连接催化剂。
尿素,固体
特殊装置
弹簧夹:5 cm 长,每块胶 5 到 7 个。
干胶架 虽然不重要,干胶架对于干燥和贮存测序用的玻璃平板是非常方便的(Bio Whitraker)。
封胶带 例如
3M Scotch Stretchable Tape(Lab Safety Supply,Janesville,Wisconsin),3M
Scotch yellow electrical tape#56(Life Technologies),3M Scotch
polytetrafluorethylene(PFTE)extruded film tape。关于不同种胶带的用法和其他封胶的方法,参见
Hengen(1996)。
胶板(配对的) 和隔板 制胶的板一块比另一块略长 3.5-4.0 cm, 或者有一块板是缺刻的。为避免胶板裂了或者漏了,最好保持板是配对的并且和测序胶的槽相对应。
手套 无滑石粉、易处理的橡胶或者聚氯乙烯(PVC)。
凡士林 可选择,见步骤 4
保护性的工作合纸 一面是塑料的(Kaydry Lab Cover from Fisher) 或者 Benchkote。
鲨鱼齿梳子 0.4 mm 厚,32,64 或 96 齿. 依赖电泳装置的能力。
有臂的烧瓶(250 ml)
隔板(厚度一致或者边缘较窄) 每胶两板,由有弹性的薄塑料板(0.4 mm) 或特氟隆(Sanger and Coulson 1978) 制成,使玻璃板隔开。在胶板和隔板之间形成不透水的封口,使未凝固的胶溶液不会漏出。 边缘窄的隔板用于制造底部比顶部厚的胶,使底部的条带比较窄并且整块胶的条带比较均匀。虽然它有这样的优点,但是比较难以制备和干燥。
注射器(60cc) 可选择,见步骤 15.
试管架
55°C 水浴
方法
重要:为防止皮肤油脂的污染. 必须一直带无滑石粉的手套,并且只能拿板的边沿。
准备胶板
1. 必要时,甩 KOH/甲醇清洗板上的旧污渍。
2. 然后用温的去污剂溶液洗涤玻璃板和间隔片,用自来水彻底冲洗,再用去离于水洗净。用乙醇冲洗玻璃板去掉水印,并放于一旁晾干。 必须小心翼翼地洗净玻璃板. 以确保灌胶时不会产生气泡。
3. 小块玻璃板的内面用聚硅氧烷溶液处理。在化学通风橱内将玻璃板放在一叠纸巾上, 内表面向上,在上面倾倒少量硅烷化液。用几张 Kimwipes 纸在玻璃板表面将硅烷化液涂布均匀,让玻璃板风干(l~2 min)。然后用去离子水洗,再用乙醇洗,风干。
4. 把大块玻璃板(干净面朝上)放在空的试管架上,把隔片放在玻璃板的两边(见图12-9)。 如果用边沿窄的隔片,把厚的一边放在板的底部。在大板和隔片之间加入小滴凡士林使隔片在下一步时不会移动。
5. 再将较小(或带凹口)的玻璃板在间隔片上放置妥当,对齐隔片。
6. 用若干个大弹簧夹(长 5 cm) 将玻璃板的一边夹起来。 在玻璃板另一边及玻璃板底部贴上凝胶密封带,形成不透水密封,必须特别注意玻璃板的底角,因为这是最容易发生渗漏的地方。
7. 将弹簧夹换到已封好的一边,在玻璃板的另一边贴上凝胶密封带。
8. 将梳子放在胶模的敞开端并检査是杏贴切适合,取出梳子将空胶模放在实验桌上。
配胶
9. 在实验桌的工作区上铺上衬塑料的保护纸。 灌制测序凝胶时几乎不可能避免将丙烯酰胺溶液滴于桌面。
10. 在一个 250 ml 有臂锥形瓶中配制适当浓度的丙烯酰胺溶液(表 12-19)。这些溶液足够配制一块 40 cmx40 cm 的测序凝胶。 注意:凝胶的配制必须一气呵成,中间不能断断续续。
11. 混合所有试剂,在 55°C 水浴中加热 3 min 帮助尿素溶解。 溶解尿素的过程十分缓慢,必须依靠外部的热量。大约的体积是 66 ml, 加水到 100 ml。
12. 从水浴中取出溶液,冷却 15 min 至室温。不断搅拌混合物。
13. 把烧瓶放在真空装置里抽去气体。 防止聚合时产生气泡。
14. 把溶液放入 250 ml 玻璃烧杯中。加 3.3 ml 新制的 16% 的过硫酸铵,混匀。 旧的硫酸铵没有足够的聚合能力,会产生模糊的条带。
15. 加 50ulTEMED,轻轻旋动容器以混匀溶液。直接配胶。或者用 60cc 注射器吸取上述溶液约 40 ml。注意,不要有气泡。 与蛋白电泳相比,已经使用了最大量的 TEMED,确保了聚合足够快和足够均匀。聚合速度与时间有关, 温度越低聚合越慢。有经验的人利甩预冷却的方法可以用一次配制的混合物制成多块 40 cmx40 cm 胶。 从此步开始,动作尽可能迅速。
16. 用手托住胶模使之与水平面大约成 45°角,沿一边从移液管中缓缓灌入溶液(参见图 12-9)。
17. 将模子放在试管架上(见图 12-9)。 这一位置减少了模子底部的水压,防止漏胶。
18. 立即将鲨鱼齿梳子的平整侧插入凝胶液约 0.5 cm 处,梳子两端插人液面的深度应当等同,以便使凝胶垂直放置时梳子的平整表面能够保持水平。 如果梳子旁边可见气泡,慢慢取出梳于。洗净梳子表面,重新插入胶中。
19. 用弹簧夹夹住梳子使之就位。将剩余的丙烯酰胺-尿素溶液沿凝胶顶部加入,形成一串丙烯酰胺液滴。让凝胶在室温下聚合 15 min。
20. 冲洗 60cc 注射器以免被聚合的丙烯酰胺所堵塞。 警告:冲洗时将释放出少量未聚合的丙烯酰胺,应戴手套。
21. 聚合 15 min 后对凝胶进行检査,观察是否恰恰在梳子平整表面之下出现一道折射率不同的 Schlieren 线,这道线是聚合理想的标志。聚合完毕后(大约 1 小时),取下弹簧夹。 警告:冲洗时将释放出少量未聚合的丙烯酰胺,应戴手套。
22. 聚合完毕后,凝胶可立即使用(见方案 11),或保存于室温达 24 小时,或保存于4°C 48 小时。为防止保存期间发生脱水,可将梳子留于凝胶内并在凝胶顶部围放一些用 1XTBE 湿润的纸巾,纸巾可用 Saran 包装膜覆盖。在这一阶段不要拔掉梳子。
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