预设 42°C 的空气培养箱 培养管 平头镊子 装有防水黑墨水（印度墨水）并带有 18 号针头的注射器

材料

缓冲液
贮存液、缓冲液及试剂的组分请见附录 1, 贮存液稀释至含适浓度。

封闭缓冲液
10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
150 mmol/L NaCl
0.05%(V/V) Tween-20
20%(V/V) 胎牛血淸
另外，也可用 5%(V/V) 脱脂奶粉或含 1% 明胶 (m/V) 和 3%(m/V) 牛血清白蛋白的 TNT 缓冲液作封闭缓冲液。至于哪种试剂最好，不同实验室各执一辞。建议研究者通过预实验来决定最佳选择。封闭缓冲液于 4°C 保存，可反复使用数次。洧液中加入终浓度为 0.05% 的叠氮化钠抑制微生物的生长。

氯仿

IPTG(10 mmol/L)

步骤 4 前，溶解 0.6 g 固体 IPTG 子 250 ml 水中。通过 0.25um 滤膜灭菌处理。

抗原-抗体复合物检测试剂：
碱性磷酸酶 (AP) 偶联抗体进行生色反应筛选试剂
辣根过氧化物酶（HRP) 偶联抗体进行生色筛选试剂
化学发光筛选试剂
每种筛选方法所用的试剂，请见步骤 15, 关于检测抗体的常用方法，请见本章末信息栏中用抗体进行免疫筛选相关内容。详情请见附录 9。

SM
室温下保存 50 ml 等份 SM. 用后丢弃以免污染。

TNT 缓冲液
10 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
150 mmol/LNaCl
0.05%(V/V)Tween-20
每筛选 10 张滤膜需大约 1 升 TNT 缓冲液。室溫保存。

洗洚缓冲液：
含 0.1%(m/V) 牛血淸白蛋白的 TNT 缓冲液
含 0.1%(m/V) 牛血涛白蛋白和 0.1%(V/V)NP-40 的 TNT 缓冲液
这些缓冲液不含叠氮化钠

放射性化合物
¹²⁵I 标记的蛋白质 A 或 ¹²⁵I 标记的免疫球蛋白（可任选）

放射性碘标记第二抗体
若用步骤 15 中放射性标记第二抗体来检测抗原-抗体复合物时可用此种抗体。

抗体

第一抗体
对于第一第二抗体的选择，参见本章末信息栏利用抗体进行免疫筛选相关内容。

培养基

LB 琼脂板
90mmPetri 平皿中应放有 30~35 ml 琼脂培养基，150 mm 板上则要有约 50 ml。平板必须干燥，否则，当硝酸纤维素滤膜移走时，上层琼脂糖会剥离。通常把两天前铺制的平板稍微打开盖放于 37°C 继续干燥 1~2 h, 效果很好，筛选过程中应使用不含氨苄青霉素的 LB 琼脂平板，因为大肠杆菌 Y1090 hsdR 在抗生素存在下生长缓慢。

LB 顶层琼脂板
将顶层琼脂于微波炉短时间融化，冷却至 47°C, 将其分成 3 ml 等份小样（用于 90 mm 平板）或 7.5 ml 等份小样（用于 150 mm 平板)，置于无菌管中，将这些等份样置于 47°C 干浴或水浴中以防凝固。



专用设备

预设 42°C 的空气培养箱

培养管（无菌 13 mmX100 mm）

平头镊子

装有防水黑墨水（印度墨水）并带有 18 号针头的注射器

硝酸纤维素滤膜
适用于结合蛋白及免疫印记反应的滤膜有不含 Triton-X100 的硝酸纤维素滤膜（Millipore HATF 或相当产品）及硝酸纤维素衍生物如 Hybond-Cextra (Amersham Pharmacia Biotech 公可)，尼龙膜或带极性尼龙膜因为背景较高及固定蛋白质能力弱不适用于免疫筛选。
用软铅笔或圆柱珠笔在滤膜上作好记号，用水打湿，夹于干燥 Whatman3 MM 滤纸之间，用铝箔将一叠滤纸包好，10psi(0.70 kg/cm²) 高压蒸汽灭菌。

附加试剂

本方案步骤 1 需第 2 章方案 1 列出的试剂。
本方案步骤 17 需第 2 章方案 1 列出的试剂。

载体及细菌株

λ噬菌体表达文库
可按第 11 章所述利用合适表达载体构建 cDNA 文库，亦可从供应商处购得，开始实验前，应按第 2 章方案 1 中所述确定噬苗体溶液的效价。

E.coli
采用不同宿主菌株进行筛选则需要不同培养基，例如：E.coli Y1090 hsdR，常可用做 λgtll 构建的 cDNA 文库的宿主菌，它在编码 ATP 依赖性蛋白酶的基因上携带一个突变在这种菌株表达的融合蛋白比在没有这种突变的菌株中更稳定。这种菌株还携带 pMC9 质粒，编码 lac 阻遏蛋白，防止β-半乳糖苷酶启动子启动细胞毒性融合蛋白的合成。9pMC9 质粒还携带选择标志（amp）, 保证不使质粒丢失。E.coli Y1090 hsdR 菌株应在含 50ug/ml 氨苄青霉素的培养基中生长（筛选除外，请见上述关于 LB 琼脂平板的注释）。对于λZAP 及其衍生物构建的文库，则用 E.coli BB4 和 XL1-Blue 菌株进行免疫筛选。此株在 F‘因子上携有 lacl 基因和四环素抗性标记（tet)。这类菌株应在含 12.5ug/ml 四环素的培养基中生长。
在应用这些宿主菌前，应熟悉其基因型及任何特殊的生长要求。

方法

λ噬菌体的平板培养

1. 取适当大肠杆菌菌株的单克隆进行接种，按第 2 章方案 1 介绍的方法制备用于铺平板的培养细菌。

2. 假定每个 90 mm 平皿和 150 mm 平皿分别可长出 2X10⁴ 个和 5X10⁴ 个噬菌斑，计算筛选文库所需平皿数。对应每个平皿准备一个无菌试管（13 mmxl00 mm), 并在试管架上依次排好。各试管分别加入 0.1 ml 用于铺平板的细菌和 0.1 ml 含所需数量λ噬菌体表达文库的 SM 溶液，置于 37°C, 溫育 20 min。
噬菌斑密度低时，免疫筛选的软果最好。噬菌斑的外周边显色反应产生的颜色最明显。因此分离效果好的免疫阳性噬菌斑呈特征性环状，而分布过于紧密的菌斑则为片状形态，相邻噬菌斑之间的共同周边上颜色强度大大减弱，不过，只要还有部分周边未与邻近噬菌斑的用边相接，就仍可辨别出阳性噬菌斑。当密度超过大约 500 噬菌斑/cm² 时，相邻的噬菌斑的周边消失，抗原阳性反应的噬菌斑也就更难分辨。所以，上面给出的每个平板所含噬菌斑数应视为免疫筛选的上限。

3. 各个试管内继续加入 2.5 ml(90 mm 平皿）或 7.5 ml(150 mm 平皿）融化的顶层琼脂糖，混匀后立即倾注到 LB 琼脂板上。凝固后平板于 42°C 温育 3.5 h。

42°C 温育是保证λ阻遏蛋白质（clts857 等位基因编码）失活及λ噬菌体发育过程中裂解程序的活化。

诱导蛋白质的表达

4. 用软铅笔或圆珠笔在硝酸纤维素滤膜上编号。手持滤膜时应戴手套，以免皮肤上的油脂影响蛋白质的转移。滤膜先在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷溶液（IPTG,10 mmol/L)中浸泡几分钟，再用平头镊子（如 Millipore 镊子）夹出放在一叠 Kimwipes 纸上，于室温晾干。

5. 从培养箱内取出平板，迅速用浸过 IPTG 的硝酸纤维素滤膜覆盖表面，与平板接触后切勿移动滤膜。将平板置于 37°C 温育，重复数次直至将所有平板都覆盖硝酸纤维素滤膜。
在平板上放置滤膜而又不藏匿气泡的最简易方法是拿住滤膜的边缘，将它稍微弯曲以使中部先与平板中央接触，利用吸水作用把滤膜吸在平板上。
将滤膜放于平板时一定要迅速，这样，平板的温度不会低于 37°C。在低于 30°C 以下时，λ噬菌体的生长会受到严重阻滞。

6. 平板于 37°C 温育至少 4 h。
初筛文库时，很难区分免疫反应噬菌斑和假阳性结果。处理滤膜时的小心操作，特定抗血清的性质，抗原抗体复合物的检测方法等多种因素都会影响假阳性的频率。一般来说，生色反应比免疫化学反应和化学发光反应的假阳性都要少。不过，即使在最佳条件下，假阳性也将以大约每平板 1 个的频率出现。为此，我们建议在复印滤膜上进行筛选，以避免二次筛选大批噬菌斑时耗费人力物力。
如果不用复印滤膜进行文库筛选，原始滤膜可在平扳上放置10~12 h 若需要复印滤膜。请见步骤 9 的相关内容。

7. 掀开平皿上盖，于 37°C 继续温育 20 min, 此步骤可加强软琼脂与平板之间的连接。

8. 把平板分批移至室温，用装有防水黑墨水并带有 18 号针头的注射器，戳穿滤膜直至下面的琼脂，在至少 3 个不对称的位置上做出标记。

9. 利用平头镊子从平板上剥离滤膜，迅速浸入大量 TNT 缓冲液中，在缓冲液中轻轻搅动滤膜洗去滤膜上残存的琼脂糖，并摇动 TNT 以防滤膜彼此粘连。
若大块琼脂糖贴在硝酸纤维素滤膜上，则先将平板置于 4°C30 min 或-20°C5 min 预冷，再剥离滤膜。

10. 待所有的滤膜都转移到 TNT 缓冲液中，用塑料膜将平板包好，4°C 保存，直至得出免疫筛选结果。




表达目的融合蛋白噬菌斑的检测

重要：下列各步骤切勿使滤膜完全干燥，本来与湿润滤膜非特异性可逆结合的抗体，一且滤膜变干，就会永久留在滤膜上。另外滤膜浸入各种缓冲液和抗体溶液时要防止它们彼此相连。为此，可把滤膜分批（每批 5 张滤膜)，毎批单用一个大平皿或结晶皿, 这样就可以减少彼此相连的问题。可将平皿互相叠在一起放在低速转动的平台式摇床上。

11. 所有滤膜全部剥离并漂洗后，逐张放在新换的 TNT 中，全部滤膜都转移完毕后，于室温继续温和搅动缓冲液 30 min。
如有必要，滤膜此时可以从缓冲液中取出，用 Satan 包装膜包好，于 4°C 保存 24 h。

12. 用平头镊子把滤膜逐张转移至含封闭缓冲液（每张 82 mm 滤膜需 7.5 ml, 每张 138 mm 滤膜需 15 ml) 的玻璃盘中，所有滤膜均浸没后，室溫下在转动平台上慢慢摇动溶液 30 min。

13. 用平头镊子把滤膜转移至含稀释的第一抗体的封闭缓冲液（每张 82 mm 滤膜需 7.5 ml, 每张 138 mm 滤膜需 15 ml) 的新鲜玻璃盘中，使用产生背景不算很高但仍可检测 50~100pg 变性抗原的最高抗体稀释度。所有滤膜均浸没后，室温下在转动平台上缓慢摇动溶液 30 min。
抗体可 4°C 保存并可反复使用数次。溶液中加入终浓度为 0.05% 的叠氮化钠抑制微生物的生长。

14. 依次将滤膜放到下列每种缓冲液中洗涤 10 min, 在缓冲液之间转移滤膜时应逐张进行， 每张 82 mm 各需用缓冲液 7.5 ml; 每张 138 mm 滤膜需 15 ml。

含 0.1% 牛血清白蛋白的 TNT 缓冲液
含 0.1% 牛血清白蛋白和 0.1%NP-40(NondidetP-40) 的 TNT 缓冲液
含 0.1% 牛血清白蛋白的 TNT 缓冲液

15. 利用所选择的放射化学、生色反应或化学发光试剂检测抗原抗体复合物。

放射化学筛选

每张滤膜需用大约 1uCi 的 ¹²⁵I 标记的 A 蛋白或免疫球蛋白，放射性标记 A 蛋白已商品化（比活 2~100uCi/ug) 放射性碘化的第二抗体可从供应商购得，或按材料前信息栏中 IgG 的放射性碘标记进行制备。

a. 用封闭缓冲液稀释放射性标记配体（每张 8 mm 滤膜需 7.5 ml, 每张 138 mm 滤膜需 15 ml)。

b. 室温下溫育 lh, 用 TNT 漂洗数次，按附录 9 中所述进行放射自显影。
继续步骤 16。

生色反应筛选

识别第一抗体种特异性决定簇的辣根过氧化物酶（HRP) 或碱性磷酸酶（AP) 偶联的抗体可向厂商购买，并按产品说明书推荐的稀释度及要求使用。一般每张 82 mm 滤膜，可将 5ul 偶联抗血清加入 7.5ul 封闭缓冲液（无叠氮化钠）中，要了解 HRP 或 AP 更多内容，请见附录 9。
联合应用 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP) 底物及氮蓝四唑（NBT) 对抗原-抗体-抗抗体-AP 复合物进行定位



a. 将滤膜放于含 AP-偶联抗体的溶液中，于室温下缓慢揺动 1.5~2 h。

b. 按步骤 14 洗涤滤膜。

c. 制备 BCIP(50 mg/ml 溶于 100% 二甲基甲酰胺）和 NBT(50 mg/ml 溶于 70% 二甲基甲酰胺）贮存液，避光保存。

d. 临用前，制备 BCIP/NET 显影液：

i. 在 AP 缓冲液中加入 33ulNBT 溶液，混匀。

ii. 加 16.5ulBCIP 贮存液，混匀，避光保存，1h 内使用。

e. 用纸巾将滤膜吸干。

f. 将滤膜沒入 BCIP/NBT 显影液（每张 82 mm 滤膜用 7.5 ml, 每张 138 mm 滤膜用 15 ml) 室温持续温育数小时。

g. 蒸馏水略洗两遍，在抗原抗体复合物处呈现深紫色。

继续步骤 16。

利用 4-氯-1 萘酚对抗原-抗体-抗抗体-HRP 复合物进行定位



a. 将滤膜放入含 HRP-偶联抗体的溶液中，于室温下轻轻摇动 1.5~2 h。

b. 按步骤 14 洗涤滤膜。

c. 将 60 mg4-氯-1 萘酚溶于 20 ml 冰预冷的甲醇制成显影液。使用前，和 100m[含 60ul 30% H2O2 的 10 mmol/LTris-Cl(pH7.5)、150 mmol/LNaCl 溶液混合。

d. 用纸巾将滤膜上的水吸干，再用 10 mmol/LTris-Cl(pH7.5)、150 mmol/LNaCl 溶液略洗一下。

e. 将滤膜浸入到 4-氯-1 萘酚显影液中（每张 82 mm 滤膜需 10 ml, 每张 138 mm 滤膜需 25 ml) 室温温育 15~20 min。

f. 蒸馏水洗涤两遍，在抗原-抗体复合物处显现深紫色。
生物素化的种特异性抗体及抗生物素蛋白质偶联的 HRP 也已商品化，应按不同厂商的使用说明书进行稀释，如上述 HRP-偶联抗体一样进行免疫筛选。
生色反应筛选后，λ噬菌体克隆可在印染的滤膜上直接挑取（Alter and Patriel990), 用解剖刀片刮滤膜的方法所获得的感染顆粒数量很不一致，每个印染印记可从 100 到 104pfu, 刮下来的印记可与 20ulSM 混合，4°C 过夜，在合适的 E.coli 菌株中按一定稀释梯度重新铺板。当然利用印染滤膜与原始噬菌斑对齐的传统方法可得到更多数量的噬菌体。然而，数量过大并非好处，因为下一步将进行重组噬菌体的噬菌斑纯化。
若使用刀刮的方法，建议再用传统的方法对滤膜和噬菌斑进行印证，尤其是筛选大的 cDNA 文库时，可做到万无一失。

化学发光筛选

化学发光反应是检测免疫阳性噬菌斑最灵敏的方法。第二抗体一般与 AP 或 HRP 偶联，使用 AP-偶联的抗体时需要如 1,2-dioxetane phosphates 这样的底物。这种底物被磷酸化后可在 466nm 波长处发光，HRP-偶联的抗体可氧化底物鲁米诺，后者在过氧化氢和苯酚存在下，可于 428nm 波长处发出强光。在两种系统中，发出的光可用放射自显影来捕获。化学发光检测快速、灵敏（1~10pg 的抗原可被检出），且可得到永久性的筛选滤膜记录（X 射线胶片)。两项潜在的缺点是试剂的高成本以及需要对放射自显影片与母板进行比较才能得到阳性克隆，下面是典型方案。



a. 将滤膜放入含 AP 或 HRP 偶联抗体的溶液中，于室温下轻缓摇动 1.5~2 h。

b. 按步骤 14 对滤膜进行洗涤。

c. 按厂家说明书制备化学发光反应底物。

d. 将洗过的滤膜与化学发光反应底物温育 1~5 min(按照厂家建议，确定最佳曝光时间）。

e. 将滤膜上多余液体除去，立即包在 Saran 包装膜中，不要使滤膜干涸。

f. 放射自显影（请见附录 9)。一般初次曝光 1 min, 然后根据此间隔来决定合适曝光时间。

继续步骤 16。

16. 对阳性斑进行定位，或与复印滤膜比较，以确定相吻合的信号。若用放射标记或化学发光探针筛选，则在光箱表面将放射自显影结果与琼脂平板比较，若用生色反应试剂筛选，在滤膜上可留下一可见的阳性残迹，继续下列步骤：

a. 滤膜上铺盖一张 Saran 或 Mylar 包装膜。

b. 在 Saran 包装膜的表面用不同颜色的防水记号笔标记滤膜上孔的位置，以及抗原阳性克隆的位置，Saran 包装膜上还应作好标记，以便找到与滤膜相对应的平板。

c. 把 Saran 包装膜放在读片光箱表面，将含有原始入噬菌体噬菌斑的平板放在膜上核对。

d. 确定阳性噬菌斑区，用巴斯德吸管的宽口吸起这一区域的琼脂块，放到加有 2 滴氯仿的 1 mlSM 中。

e. 保存 Saran 包装膜作为阳性噬菌斑定位的永久记录，至于原滤膜上的有色斑点很快就会消退。

17. 于 4°C 放置若干小时后，使噬菌体从琼脂块中洗脱出来。确定洗脱液中噬菌体的滴度，重新按大约每个 90 mm 平皿 3000 个噬菌斑的密度铺板培养。按上述方法从步骤 4往后再次筛选噬菌斑，反复筛选和铺板。直至得到一致的免疫阳性重组噬菌体。