基本方案
缓冲液梯度测序胶
电解质梯度测序胶
含甲酰胺的测序胶
实验材料 | DNA |
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试剂、试剂盒 | 乙醇 异丙醇 二甲基二氯硅烷 TEMED 变性丙烯酰胺溶液 SDS |
仪器、耗材 | 电泳仪 注射器 巴斯德吸管 干胶机 |
实验步骤 |
1. 制作每块凝胶时,首先要用肥皂及水小心严格地清洗两块30 cm×40 cm的前后玻璃平板,用去离子水冲洗后晾干,用喷射洗瓶喷10%乙酵或异丙醇使平板湿海。
5. 按厂商指南用0.2~0.4 mm 均厚的垫片和大的书本装订夹子组装凝胶胶模夹层,注意垫片与平板的边、底压紧对齐。
7. 立即灌胶,用60 ml 注射器小心吸出丙烯酰胺溶液,避免吸入气泡,让短平板朝上, 并使凝胶平板夹层与臬面成45度角,沿着平板的一边慢慢将丙烯酰胺溶液推入两片平板之间,其间可调整角度让胶液慢馒流入夹层的一边。
14. 凝胶电泳装置的下层贮液槽加入1XTBE缓冲液,使凝胶夹层能浸泡在2~3 cm 的一层缓冲液中,放入凝胶夹层并用夹子固定在电泳装置上。
16. 将清洗干净的鲨鱼齿样品梳重新播回凝胶夹层,使其齿部仅可触及凝胶,用巴斯德吸管或Beral细管以1×TBE缓冲液彻底清洗加样孔,以除去零星的聚丙烯酰胺碎片。
17. 加样前,在45 V/cm 凝胶的电压降下预电泳,使凝胶预热,即在1 700 V,70 W 恒功率下电泳约30 min。
19. 在甲酰胺/染料溶液中的样品,盖好盖子,在95℃加热2 min,然后置于冰上,每孔加 样2~3 μl 测序用的加样吸头可于每次加样后在下槽缓冲液中冲洗2次后继续使用。
27. 一旦平板分离后,取去另一边的垫片及除去凝胶周围多余的聚丙烯酰胺碎片。
28. 如果样品含32P或33P,固定步骤可用可不用。如果样品含33S,直接将凝胶连同玻璃平板一起放入浅托盘中,轻轻覆盖一层约2 cm 的5%乙酸 / 5%甲醇固定液,浸泡10~15 min,不时轻轻摇动托盘使凝胶与玻璃平板松开。
29. 将疑胶重新置于平板上,靠吸力或重力除去固定液注意保持凝胶处于平极的中央, 小心从托盘中将平板连同凝胶取出,放在工作平台上。
33. 从干胶上揭去保鲜膜,将干胶放在X光曝光盒中,Kodak XAR-5X光胶片直接与凝胶接触,室温放射自显影,经足够时间曝光后(一般需过夜)取出X光胶片并冲印。
展开 |
其他 |
变性聚丙烯酰胺凝胶中相对于示踪染料的寡核苷酸的迁移
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