总DNA质量检测及酶切实验

水稻DNA BAC克隆DNA

琼脂糖 限制性内切酶DraI EcoRI EcoRV HindIII 凝胶

水浴锅琼脂糖电泳仪

1.  取10 μl DNA于0.8% 凝胶检测；

2.  将DNA调节浓度至300-400 ng/μl ；

3.  仔细阅读将所用的任何一种酶产品说明书，熟悉反应条件及酶切的贮存浓度（10U-50 U/μl）厂家配套试剂；

4.  计算据反应条件所需要的各种试剂准确用量：（0.5 ml tube中）
DNA(3-5 mM)              10 μl
buffer reaction       ´10    1.5 μl
Enzyme (15 U/μl)           0.8 μl（冰上）
ddH₂O                  2.7 μl
混匀，短暂离心；

5.  37 ℃   温浴1-2 hrs (纯DNA)   或10 hrs（粗制DNA）；

6.  加入上样缓冲液终止酶切反应，也可65 ℃加热10 min使酶变性失活；

7.  电泳检测酶切效率：
每个样品取1/10量用琼脂糖电泳检测，制胶及点样方法同上。

1.酶解不一定要过夜,不过反应时间越长所用的酶量就越少。与用酶解鉴定载体/插

入片段相比,酶解基因组DNA所用酶浓度要高一些,一般1μg基因组DNA需加入5U内切酶。

2.若电泳条带靠近加样孔的一端比另一端亮得多,表明酶切不完全。这可能是因为:①反应时间不够长(若反应过夜则可排除此项);②酶量不够或酶部分失活;③如果初始DNA样品溶于TE缓冲液中且在酶解反应中所占的体积较大时,TE缓冲液中的EDTA可能抑制酶解反应,这时可以用乙醇重新沉淀DNA,然后溶于少量TE缓冲液或SWD中。

3.选用的DNA相对分子质量其涵盖的相对分子质量范围要大,如λHindⅢ可涵盖500bp到23kb的范围。

4.DNA样品经消化后在各泳道中条带的亮度应一致,否则表明各样品浓度不一致。DNA浓度通常难以精确测定,可以通过调节上样体积来调节DNA的上样量。