放射性标记的探针与固定在膜上的核酸的Southern杂交

固定于膜上的 DNA 无菌水配的 poly (A) RNA DNA 或 RNA 探针 鲑鱼精 DNA

磷酸-SDS 洗液 预杂交 杂交液 水相缓冲液杂交用溶液 甲酰胺缓冲液杂交用溶液

放射性墨水标记的不干胶标签或者磷光不干胶标签 杂交瓶 预先调到适宜温度的孵箱或商业获得的杂交装置 孵箱或水浴振荡器 沸水浴

一、材料

1. 缓冲液及溶液

磷酸-SDS 洗液 1（40 mmol/L Na₃PO₄ （pH 7.2)，1 mmol/L EDTA ( pH 8.0)，5% (m/V) SDS，0.5 (m/V)牛血清白蛋白成分 V）

磷酸-SDS 洗液 2（40 mmol/L Na₃PO₄ （pH 7.2)，1 mmol/L EDTA ( pH 8.0)，5% (m/V) SDS）

预杂交/杂交液

水相缓冲液杂交用溶液（6X SSC ( 或 6X SSPE)，5X Denbardts 试剂，0.5%（m/V) SDS，1 μg/ml poly (A)，100 μg/ml 鲑鱼精 DNA，50%（V/V）甲酰胺）

甲酰胺缓冲液杂交用溶液（0.5 mol/L Na₃PO₄ （pH 7.2)，1 mmol/L EDTA ( pH 8.0)，7% (m/V) SDS，1% (m/V) 牛血清白蛋白）

Na₃PO₄ （1 mol/L，pH 7.2)

2. 核酸及寡聚核酸

固定于膜上的 DNA

无菌水配的 poly (A) RNA (10 mg/ml)

DNA 或 RNA 探针

鲑鱼精 DNA ( 约 10 mg/ml)

3. 专用设备

放射性墨水标记的不干胶标签或者磷光不干胶标签

杂交瓶

预先调到适宜温度的孵箱或商业获得的杂交装置

预先调到 65℃ 的孵箱或水浴振荡器（应用于磷酸-SDS 缓冲液中的杂交）

沸水浴

二、方法

1. 将含有靶 DNA 的膜漂浮在盛有 6X SSC ( 或 6X SSPE) 的皿中直到膜自下而上完全浸湿。将膜浸于溶液中 2 min。

2. 用下列方法之一进行预杂交

(1) 在热密封的袋中进行的杂交

① 将膜塞入热密封袋中（如 Sears Seal-A-Meal 或相应设备)，按每平方厘米 0.2 ml 加入预杂交液中。尽量将袋中的空气挤出。

② 用热封口机密封袋的开口端两次。轻轻挤压袋子以检查密封的强度及是否完整。 将袋子放在适宜温度的水浴中（水性溶剂杂交液 68℃；含有 50% 的甲酰胺的杂交液 42℃；磷酸-SDS 杂交液 65℃）。

(2) 杂交瓶中进行的杂交

① 轻轻的将湿润的膜卷成圆柱状与制造商提供的塑料网一起放入杂交瓶。按每平方厘米膜 0.1 ml 加入预杂交液。将瓶盖拧紧。

② 将杂交管放入预先加热到适宜温度的杂交炉中（水性溶剂杂交液 68℃；含有 50% 的甲酰胺的杂交液 42℃；磷酸-SDS 杂交液 65℃)。

(3) 塑料容器中进行的杂交

① 将湿润的膜放在塑料（如 Tupperware) 容器中，按每平方厘米膜 0.2 ml 加入预杂交液。

② 用盖子密封盒子，将盒子放入预设到适宜温度的空气孵箱中的振荡平台上（水性溶剂杂交液 68℃；含有 50% 的甲酰胺的杂交液 42℃；磷酸-SDS 杂交液 65℃ )。

3. 如果放射性标记的探针是双链 DNA，100℃ 加热 5 min 变性，迅速将探针放入冰水浴中冷却。

4. 若要使探针与包含基因组 DNA 的膜杂交，请按照下列方法之一进行

(1) 在热密封的袋中进行的杂交

① 迅速将装有膜的塑料袋从水浴中取出。用剪刀剪开一角打开袋子，将预杂交液倒出。

② 将交性的探针加到适量的新鲜预杂交液中，并将溶液转入袋子。尽量将袋中的空气挤出。

③ 用热封口机重新密封袋子；使袋中尽可能少地残留气泡。为了避免水浴的放射性污染，将重新封口的袋子密封于另一个未污染的袋子中。将袋子浸入适宜所需杂交阶段温度的水浴中。

(2) 在杂交瓶中进行的杂交

① 将预杂交液从杂交瓶中倒出并加入新鲜的含有探针的杂交液。

② 封好瓶口重新放入杂交炉。放盘在适宜的温度下。

(3) 在塑料容器中进行的杂交

① 将膜从容器中转移到密封的袋子或杂交瓶中。

② 迅速按照上述方法处理。

5. 杂交后，洗膜。

(1) 在热密封袋中进行的杂交

① 带上手套，将袋子从水浴中取出，去掉外层的袋子，迅速地将内层袋子剪去一角。 将杂交液倒入处理放射性污染的废液缸中，然后沿三边将袋子剪开。

② 将膜取出迅速浸入含有数百毫升 2X SSC 及 0.5% SDS 的皿中（即每平方厘米膜约 1 毫升），室温下将平皿放在缓慢的旋转平台上轻轻振荡。

(2) 在杂交瓶中进行的杂交

① 将膜从杂交瓶中取出，夹住露出瓶口的膜的一角将多余的杂交液晾干。

② 将膜没入含有数百毫升 2X SSC 及 0.5% SDS 的皿中（即每平方厘米膜约 1 毫升室温下将平皿放在缓慢的旋转平台上轻轻振荡。

6. 5 min 后，将第一遍洗液倒入处理放射性污染的废液缸中，在皿中加入数百毫升 2X SSC 及 0.1 % SDS。室温下放置 15 min 并轻轻振荡数次。

如果杂交是在磷酸-SDS 缓冲液中进行的，将膜浸入 65℃ 的磷酸-SDS 洗液 2 中共 8 次，每次 5 min。然后直接进行步骤 9。

7. 将浸泡的溶液换成数百毫升新鲜的含有 0.1% SDS 的  0.1X SSC。65℃ 下放置 30 min~4 h，并轻轻振荡。

8. 室温下用 0.1X SSC 洗膜。

9. 将膜放在一叠纸巾上以去除大部分液体。将潮湿的膜放在一张 Saran 包装膜上。在 Saran 包装膜上取几个不对称的位置贴上用放射活性墨水（或磷光点）标记的黏性点标签。这些标记物可以与膜一起进行放射自显影。用 Scotch 膜覆盖标签。这样可以避免污染显影夹或使放射性墨水污染增感屏。

也可以将膜在空气中干燥后用水溶性胶水黏在一张 3 MM 滤纸上。

10. 用 Saran 包装膜覆盖膜，放在增感屏内 -70℃ 用 X 线片曝光 16~24 h 以获得放射自显影的图像。