| 实验方法原理 |
此方案中 cDNA 的合成是在 4 种饱和浓度的 dNTP 及一种痕量的放射性标记的 dNTP 中进行的。扣除杂交后，在大肠杆菌
DNA 聚合酶Ⅰ的 Klenow 片段作用下，富集的单链 cDNA 通过随机寡核苷酸引物延伸的二次合成反应，标记成高比活性的探针。由
于第一轮反应中 dNTP 的浓度为非限制性的，所生成 cDNA 的量及大小均高于标准方案，因此扣除杂交步骤以高效进行。由此产生的 cDNA
群体不易受辐射分解的破坏，从而可长期贮存，必要时尚可标记成较高比活性的探针。 |
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| 实验材料 |
大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段 反转彔酶 随机脱氧核苷酸引物 模板 mRNA |
| 试剂、试剂盒 |
二硫基苏糖醇 乙醇 EDTA NaOH 胎盘 RNA 酶抑制剂 随机引物缓冲液 醋酸钠 dNTP 溶液 |
| 仪器、耗材 |
Sephadex G-50 离心柱 微量离心管 水浴 |
| 实验步骤 |
一、材料
1. 缓冲液和溶液
二硫基苏糖醇（DTT) (1 mol/L）
EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)
乙醇
HCl ( 2.5 mol/L)
NaOH ( 3 mol/L)
酚：氯仿（1:1，V/V)
胎盘 RNA 酶抑制剂
5X 随机引物缓冲液（250 mmol/L Tris ( pH 8.0)，25 mmol/L MgCl2，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L DTT，1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 调至 pH 6.6)，使用 1 mol/L DTT 贮存液的新稀释水溶液，贮存于 -20℃。用后弃去稀释的 DTT。）
SDS ( 20% m/V)
醋酸钠（3 mol/L，pH 5.2)
Tris-Cl (1 mol/L，pH 7.4)
2. 酶与缓冲液
大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段
反转彔酶
10X 反转录酶缓冲液
3. 核酸与寡核苷酸
含 4 种 dNTP 各 5 mmol/L 的（完全）dNTP 溶液
含 dCTP、dGTP 和 dTTP 各 5 mmol/L 的 dNTP 溶液
oligo (dT)12-18
长度为 6 或 7 个碱基的随机脱氧核苷酸引物
模板 mRNA
4. 放射性复合物
[α-32P] dATP ( 10 mCi/ml，比活性为 >3000 Ci/mmol）
[α-32P] dCTP ( 10 mCi/ml，比活性为 800~3000 Ci/mmol）
5. 专用设备
Sephadex G-50 离心柱，平衡于 TE（pH 7.6)
硅化的微量离心管（1.5 ml）
预热至 45℃、60℃ 和 68℃ 的水浴
二、方法
1. 4℃ 下在一个灭菌的微量离心管中混合下列成分以合成 cDNA 第一链：
模板 RNA (1 mg/ml） 10 μl
oligo(dT)12-18 （1 mg/ml） 10 μl
5 mmol/L dNTP（完全）溶液 10 μl
50 mmol/L DTT 1 μl
10X 反转录缓冲液 5 μl
10 mCi/ml [α-32P] dCTP 5 μl
( 比活性 800 或 3000 Ci/mmol）
胎盘 RNA 酶抑制剂 25 单位
无 RNA 酶的水 加至 46 μl
反转录酶（~800 单位） 4 μl
2. 检测放射性标记的 dNTP 掺入 TCA 可沉淀物或结合于 DE-81 滤膜的比率。用下列公式计算 cDNA 第一链的产率。
3. 加入下列试剂以终止反应：
0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 2 μl
20% (m/V) SDS 2 μl
充分混匀微量管中的各成分。
4. 在反应管中加入 5 μl 3 mol/L NaOH，于 68℃ 温育反应 30 min 以水解 RNA。
5. 将反应物温度冷至室温。加入 10 μl 1 mol/L Tris-Cl (pH 7.4)，充分混匀以中和溶液，然后加 5 μl 2.5 mol/L HCl。点一小滴溶液（<1 μl）在 pH 试纸上以检测溶液的 pH。
6. 用酚:氯仿抽提纯化 cDNA。
7. 用 Sephadex G-50 离心柱层析分离放射性标记的探针与未掺入的 dNTP。
8. 进行两轮扣除杂交。
9. 用异丁醇序贯抽提浓缩 cDNA，通过 Sephadex G-50 层析除盐。
10. 用标准乙醇沉淀回收 cDNA。将 cDNA 溶于水，终浓度为 15 ng/μl。
11. 为了对扣除 cDNA 进行高比活性的放射标记，在一个 0.5 ml 微量离心管中混合下列成分：
扣除 cDNA 5 μl
随机脱氧核苷酸引物（125 μg/ml） 5 μl
12. 加热混合物至 60℃ 5 min，然后冷却到 4℃。
13. 向引物：cDNA 模板混合物中加入：
5X 随机引物缓冲液 10 μl
含 dCTP、dGTP 和 dTTP
各 5 mmol/L 的 dNTP 溶液 5 μl
10 mCi/ml [α-32P] dATP
( 比活性为 >3000 Ci/mmol） 25 μl
Klenow 片段（12.5 单位） 2.5 μl
水 加至 50 μl
室温下反应 4~6 h。
14. 加入下列试剂以终止反应：
0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0) 1 μl
20% (m/V) SDS 2.5 μl
15. 用 Sephadex G-50 离心柱层析分离放射性标记的 cDNA 与未掺入的 dNTP。
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