| 实验步骤 |
一 材料与设备
1) 亲和素-磁珠 (SA-PMP)
2)GTC 抽提缓冲液:4moL/I, 异硫氰酸胍，25 mmol/L 柠檬酸钠，pH:7.1
3) 生物素标记的 oligo(dT) 探针（50pmol/ul)
4) 稀释缓冲液：6XSSC，lmmol/L Tris-HCl，PH 7.4，10 mmoL/L EDTA，0.25% SDS
5)β-巯基乙醇 (48.7%)
6) 无 RNase 水
7)20XSSC:67.7 g NaCl 和 44.lg 柠檬酸钠溶于 400 ml 去离子水中，用 NaOH 调 pH 至 7.2, 加水至 500 ml 体积，用 0.1% DEPC 处理过夜，高压灭菌
8)0.5XSSC: 20XSSC 用无 RNase 水稀释而成
9)1XPBS
10) 磁架
11)75℃ 水浴
12)50 ml 无菌 Corex 离心管
13)15 ml 螺旋盖锥形离心管
14)Tissuemizer DM 或其他同类匀浆器
15)BeckmanJ2-21 离心机或其他类似设备
二 操作方法
以重量小于 0.125 的组织中 mRNA 的纯化为例, 大量组织和细胞中 mRNA 的纯化可参阅相关产品说明书。
1) 从冰箱中取出 GTC 抽提液、生物素标记的 oligo(dT) 探针、无 RNA 酶的水及 0.5XSSC, 平衡至室温并预热稀释液至 70℃
2) 在 50 ml 无菌螺旋盖锥形离心管屮，首先加入 lml 抽提液（抽提/BME 缓冲液）然后再向其中加人 41ul β-巯基乙醇 (48.7%)，保证β-巯基乙醇的终浓度为 2%。井将装有缓冲液的管子称重并记录。
3)
尽可能快地取得所需量的组织并放人到装有抽提/BME
缓冲液的管中，使用小匀浆器髙速匀浆组织至无可见组织块。如果无匀浆器，则可将组织快速切碎，液氮冷冻，在装有液氮的研钵中捣碎研磨。将液氮和组织转移到无菌的
50 ml 螺旋盖锥形管中，液氮挥发后，立即加人抽提/BME 缓冲液，使之完全混合
4) 将含有组织及抽提/BME 缓冲液的骨子称重，减去第 2) 步中的管重并计算组织块的大小。
5) 参考图 2.1，根椐第 4) 步计算的组织块大小决定生物素标记的 oligo(dT) 探针用量和亲和素-磁珠 (SA-PMP) 用量。
6) 将 2 ml 预热稀释缓冲液加到无菌管中，加入 41ul β-巯基乙醇 (48.7%)，终浓度为 1%。将此溶液加至匀浆液中. 完全混合。再加入第 5 步确定的探针，晃动以充分混合，并在 70℃ 温育 5 min
7) 转移匀浆液至一清洁无菌的 15 mlCorex 管屮，室温 12000 g 离心 10mim
8) 离心时，轻轻晃动使 SA-PMP 完仝悬浮，将所需量的磁珠转移到一无菌的 50 ml 螺旋盖锥形管中，将此管放置在磁架上。水平放置磁架至磁珠全部聚集在管的一侧。倾斜管子使溶液不流经磁珠表面. 小心倒掉储存液
9) 用等体积的 0.5XSSC 悬 SA-PMP，用磁架捕捉，按第 8 步倒掉 SSC 溶液。重复洗涤两次后，将 SA-PMP 重悬在初始体积0.5XSSC 中。
10) 勻浆液离心完成后，小心取出上清，避免吸取沉淀。将已澄清的匀浆液加人含洗涤好的 SAPMP 的管中，翻转混合。
11) 将匀浆液及 SA-PMP 室温孵育用磁架捕捉 SAPMP 至勻浆液淸澈. 按前述方法小心倾去上清液。用一无菌管收集上清液，放在冰上保存直至能肯定 mRNA 已获得令人满意的结合和洗脱
12) 于 lml0.5XSSC 中宙悬磁珠，再转移到 2 ml 试管中. 用磁架捕获磁珠，小心倾去 SSC，重复洗涤两遍。最后一次洗后要尽可能多地去除 SSC 而不搅动 SA-PMP。
13) 用 0.5 mL 无核酶的水洗脱 mRNA，轻振试管重悬 SA〜PMP。
14) 用磁架捕捉 SA-PMP，将洗脱的 RNA 转移到无蔺小离心管中。用无菌水重悬磁珠，保存在冰中直至 mRNA 产量和纯度被确定。
15) 向洗脱液中加入 0.1 倍体积的 NaAc（用于 cDNA 克隆) 或 KAc(用于体外翻译) 和 1 倍体积的异丙醇，放置过夜。
16) 于 12000 g 离心 10min，用 1ml 70% 乙醇重悬 RNA 沉淀 T 再离心
17) 真空干燥沉淀 15 min 用无 RNase 的去离子水溶解沉淀。
展开
|
首页
