实验步骤 |
(一)材料与设备
1) 水平电泳装置
2) 水浴
3)10XMOPS 电泳缓冲液:0.2mol/LMOPS(PH7.0),20 mmol/L 乙酸钠,10 mmol/LEDTA(pH8.0)
4) 甲醛;37% 溶液(13.3mol/L)
5) 甲酰胺(去离子):将 10 ml 甲酰胺和 lg 离子交换树脂混合,搅拌 lh 后用 Whatman 滤纸过滤,等分成 1 ml 于一 70°C 储存。
6)10X 加样缓冲液:10 mmol/LEDTA(pH8.0),0,25% 溴酚蓝,0.25% 二甲苯青,50% 甘油
7) 溴化乙锭
8)琼脂糖
9)DEPC 处理的水
(二)操作方法
1)
凝胶制备:制 100 ml. 含冇 2.2mol/L 甲醛和 1I.5% 琼脂糖凝胶。将 1.5 g 琼脂糖溶解在 72 ml.
水屮,微波炉加热溶解后冷却到 55X:, 加入 10 ml10XMOPS 电泳缓冲液和 18 mL, 去离子甲醛,然后灌胶。
2) 样品制备;分光光度下测以确定的浓度。如果 RNA 浓度太低 (<lmg/ml),可用乙醇或异丙醇沉淀浓缩。
3) 电泳:在 l.5 mL 的离心管中加入下列组分进行变性反应,
RNA〔最多 20ug) 2ul
10XMOPS 2ul
甲醛 4ul
甲酰胺 10ul
溴化乙锭(200ug/ml) 1ul
混匀后,于 55℃ 保温 60 min 使 RNA 变性,冰中冷却 110 min, 离心,加 2ul10X 加样缓冲液混匀,置于冰上,上样电泳,用1XMOPS 作电泳缓冲液,直到溴酚蓝到达凝胶的底部。在紫外灯下观蔡结果。
4)RNA 的分子质量标记。①使用商品化 RNA 分子的大小标准.②利用细胞中两个主要核糖体 RNA:18S(约 2.lkb) 和 28S(约 4.5kb) 作分子质量参照。
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