荧光RNA随机引物触发的聚合酶链反应实验

2019.9.12

184****5725

致力于为分析测试行业奉献终身

实验步骤	##一、从组织和培养细胞中分离RNA 1.TRIzol试剂（Invitrogen)。该试剂含有苯酚和硫氰酸盐化合物，操作时应穿实验服，戴手套，存放于 4°C 。 2.氯仿。 3.异丙醇。 4.乙醇。 5.焦炭酸二乙酯（DEPC) 处理的水。 6.无DNA试剂盒（Ambion)。贮存于一 20°C 。 ##二、 CDNA 合成 1.Superscript™ II， RNase H-反转录酶（200 U/(nL; Invitrogen)。一 20°C下可稳定忙存两年以上。 2.5X 第一链合成缓冲液： 250 mmol/LTris-HCI， pH 8. 3， 375 mmol/L K C l, 15 mmol,L MgCl2，贮存于一 20。。。 3.0. lmmol/L 二硫苏糖醇（DTT)，贮存于一 20°C 。 4.dNTP 混合物： dNTP 各 1 0 mmol/L ，贮存于一20°C 。 5.18 碱基的随机引物（25 pmol/L ): A 3， 5'-AATCATGAGCTCTCCTGG——3';B3, 5』-CATACACGCGTATACTGG——3』； C3, 5'-CCATGCGCATGCATGAGA- 3 : 贮存于一20。。。 6.RNaseOMT™ 重组核糖核酸酶抑制剂 UOU/^L ; Invitrogen), I t 存于一20℃ ##三、 FRAP-PCR 1.QiagenT叫 D N A聚合酶（5 U/\|uL; Qiagen)， \|^；存于一20。 C 。 2.Qiagen IOXPCR 缓冲液： Tris-HCl， KCl，（NH4)2SO4， 15 mmol/L MgCl2，p H 8.7, C 存于一20°C 。 3.25 mmol L MgCl2， I t存于一20°C 。 4.焦炭酸二异酯（DEPC) 处理过的水。 5.dNTP 混合物： dNTP 各 1 0 mmoL/L ， JC 存于一20° C 。 6.5'端用罗丹明标记的随机引物（lOfxmol/L ; A3、 B3 或 C3)，贮存于一20°C ，避光。 7.QIAquick PCR 纯化试剂盒（Qiagen) ##四、凝胶电泳 1.制胶溶液： 6 % 丙烯酰胺（29: 1 丙烯酰胺-bis丙烯酰胺），含 7 mol/L 尿素和1XTBE缓冲液。 2.1父丁6£缓冲液： 89 1^11 〇 1， 1 1 1 ^ 碱， 89 111111〇 1/1^硼酸， 2 111111〇 1/乙£0丁八二钠盐， pH 8. 3。 3.上样缓冲液： 9 9 % 甲酰胺， I mmol/L EDTA， pH 8.0，〇. 〇〇 9% 二甲苯氰，0.009% 溴酚蓝。 4.TEMED。 5.25% 过硫酸铵。 6.FDD垂直电泳系统，包含 60孔梳子和低背景荧光的玻片（GenHunter)。 7.Sigmacote 桂胶液（Sigma-Aldrich)， JC存于 4°C 。 8.可提供电压>1700 V 的直流电源。 9.突光成像扫描仪： Typhoon 9210 可变模式成像仪（Amersham)。 10.可打印 llin X 17in® & 的喷墨打印机，用于打印实际尺寸的凝胶图像。 11.刀片。 ##五、 PCR 产物的分离、再扩增和克隆 1.胶原（20 叫 ZmL), C 存于_20°C 。 2.3 mol/L 乙酸钠。 3.乙醇。 4.焦炭酸二乙酯（DEPC) 处理过的水。 5.PCR 试剂，见 2.3 (注意： lOfxmol/L 未标记的随机引物）。 6.TOPOTA® 克隆试剂盒（Invitrogen)。 OneShot® 感受态大肠杆菌贮存于—80°C , PCR TOPO® 克隆载体贮存于一2CTC。 7.SOC 培养基： 2 % 胰蛋白胨， 0 . 5 % 酵母提取物， 10 mmol/L NaCl， 2. 5 mmol/L KC1， 10 mmol/L MgCl2， 10 mmol/L MgSO4， 20 mmolZL 葡萄糖。 8.L B 培养基。 9.氨节西林（1 0 mg/mL)， JC存于一20°C 。 10.琼脂。 11.X-gal (20 mg/mL)，避光忙存于_2 〇 °C 。 12.M13 引物：正向（5'-GTAAAACGACGGCCA0 3 ' ) ，反向（5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3')，贮存于一20°C 。 13.QIAprep 离心法小量质粒抽提试剂盒（Qiagen)。3. 方法 ##六、从组织或培养细胞提取 RNA RNA可以从各种来源的样本包括培养的细胞（例如神经元细胞、肝细胞等）和组织中分离得到（见注释 1) 。 mRNA 的纯化对 FRAP-PCR 方法来说并不需要，因为mRNA 仅占细胞总 R N A 的 3 % 〜5 % (13)。因而在本章所描述的方法适用于可得到的总 RNA 有限的情况下（如少量的细胞或组织）。细胞总RNA易于纯化但在用于FRAP-PCR 前需用 DNase 处理（见注释2) 并根据每次的用量分装于一次性管子中(见注释3)。每次实验总RNA的使用量均约为750ng(见注释4)。 1.培养板每一孔的原代细胞（约 1.2 mg) 用 100 A TRIzoI 溶解，或每 50〜100mg 组织加 I mL TRIzol, 用勻浆器 Mixer Mill MM 300 (Retsch)和碳化鹤合金珠在 20 Hz 匀浆处理 2 min (见注释 5)。 2.将匀浆后的样品在室温放置 5 min，使得核蛋白复合体完全解离。 3.每 I mL TRIzo 丨加人 0. 2 mL 氯仿，用手剧烈振荡管子 15 s，室温放置 2〜3 min。 4.4°C 下 12 000 g■离心 15 min。 5.转移上层水相（约起始 TRIzol 体积的 6 0 % ) 至一新管中，按每 Im L TRlzoI 力口0.5 m L 的异丙醇，颠倒几次混匀。在室温放置 10 min, 然后 4°C ， 12 OOOg 离心 20 min。 6.移去上清，按每 I mL TRIzol 的初始用量用 I mL 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀，振荡混匀，并于 4°C , 7500 g 离心 5 min。 7.室温下干燥 RNA，用<100 fxL的 DEPC处理过的水溶解。 8.用分光光度计测定RNA浓度。 9.为了去除基因组 D N A 的污染，在 50 反应体系中按每1 0 鸿 R N A加 5 (uLDNase I 缓冲液和 I fxL 重组 DNase I (2 UZfjtL)。 37°C 孵育 20〜30 min。 10.加10 juL DNase I 灭活剂并在室温下放置2 min，然后 10 000 g 离心 I.5 min,将RNA转移人一新的离心管内。 11.再次测定RNA浓度，稀释至75 ng/fx L ，每管 IOfL 分装，于一 80°C保存。 ##七、CDNA 合成在这项技术中使用了 18 碱基的随机引物而非〇 lig0-d T 引物，以确保合成的反转录产物不偏向于3'端非翻译区。这使得内部包括可读框的 R N A序列可被反转录成cDNA，从而有利于下一步基因产物的鉴定。这点对于基因组序列未知的种属有特殊的意义（如银鸥、野鸭等)。同时，需设立不加反转录酶的对照，用以确定在随后的 PCR 实验步骤中是否有基因组 D N A 的污染（非反转录反应的对照， no RTcontro丨)。此外,商业化的 RNA (例如从转化的大鼠成纤维细胞来源的无D N A污染的总 RNA， GenHunter) 可作为反转录依赖的 mRNA 扩增反应的对照（contr〇l RNA)。 1.将 10 fzL 75 ng/juL 的总 RNA 和 I dNTP 混合物， I /xL 随机引物（A 3、 B3或〇 3; 25_〇 1/乙）混合。 65°(：孵育 5 111 丨 11 ，立即置于冰浴，稍加离心。 2.加入4 pL 5X 第一链合成缓冲液， 2 DTT, I pL R N A 酶抑制剂 RNase Out和 I /xL Superscript™ ] ! 反转录酶。 3.在 25°C孵育 10 min后于 42°C孵育 50 min. 4.70°C 加热 15 m in 以终止反应。 5.cDNA每管 5 分装，于一20°C保存，用于随后的 PCR 反应（见注释 6)。 ##八、 FRAP-PCR 罗丹明是光敏性的染料，因此所有的操作过程均需要在暗处进行，包括引物、工作液及包含荧光标记物的 PCR 产物。 1.每个25 fxL的反应体系应包括： 5 pL cDNA, 2.5 fiL 10XPCR缓冲液， 1. 5 ，MgCl2， 0 •5 fJL dNTP混合物， 1. 25 ML 罗丹明标记的引物（A3、 B3 或 C3),0. I fxL Qiagen Tag DNA 聚合酶， 14 15 pL DEPC 处理过的水。 2.PCR参数设置： 3.将 PCR 产物保存于 4°C , 暗处避光。 4.用 Qiagen PCR 清洁试剂盒（QIAquick Nucleotide Removal kit) 纯化 PCR 产物(见注释9)。 5.加125 斗 PB缓冲液至25 ;xL PCR 产物中，混匀。 6.将QIAquick柱子放置于 2 m L 收集管中，把上一步混匀的样品加到柱子上，17 900 g离心 30〜60 s。 7.弃去过柱的液体，将纯化柱放回收集管中。 8.加 0 •75 m L 的 PE 缓冲液于纯化柱上，离心 30〜60 s。 9.将滤液弃去，纯化柱放回收集管，再离心 Im in 以除去残留的缓冲液。 10.将纯化柱放置于另一干净的L 5 mL 离心管中。 11.在柱子的膜中间位置加人3〇 fxL EB缓冲液，室温静置Im in, 离心洗脱DNA。 ##九、凝胶电泳 1.将玻片的内表面擦拭干净，并用被液处理带有凹槽的玻片内表面。装好玻片成「三明治」，将边缘封口以防胶聚合前泄漏。 2.配置 6 % 的变性聚丙烯酰胺凝胶。垂直电泳系统（长 45 cm, 宽 25 cm) 约需 50m L聚丙烯酰胺溶液。同时需加 1OO 新鲜配制的过硫酸铵和50 /xL TEMED并混勻。 3.将配置好的凝胶溶液沿着玻片上缘加人，插入加样梳，让其聚合过夜。在胶体溶液的上面盖上湿纸巾和保鲜膜防止溶液蒸发干。 4.聚合后，先在 1500 V 的电压下预电泳45 min。上下缓冲液槽共需用约750 mL IX T B E 电泳缓冲液。 5.将3〇 /iL PCR 产物和15 FDD上样缓冲液混匀，并设置恰当的对照（非转录反应的对照和control反转录依赖的mRNA扩増反应的对照），在 80°C 孵目 '2 min后取 5 juL上样（见注释 10)。上样前，用移液器冲刷每个上样孔。每份样品上样三个平行孔。 6.在 1700 V 电泳6 h 后，取出凝胶，根据对罗丹明的操作指南，用 Typhoon成像仪扫描（激发透镜为532 nm, 发射透镜为580 nm BP30)。确保非转录反应的对照加样孔泳道为空白，而反转录依赖的mRNA扩增反应的对照泳道有条带出现。 7.根据实际尺寸将凝胶图谱打印出来，将胶放于打印出的图谱上用保鲜膜包裹整块凝胶，以防止水分蒸发。 8.用干净的刀片将感兴趣的条带切下，重新扫描确定切割的是正确的条带。所切割获取的条带应该显示为有/无模式（图 1)。 ##十、PCR产物的分离、再扩增和克隆 1.将割取的胶条置于I.5 m L离心管中，室温下用 1〇〇斗水浸泡10 min。 2.扣紧离心管盖子， >95°C孵育 15 min，离心 2 min。 3.转移上清到另一离心管；加入 IOyL 3 mol/L 乙酸钠， 2.5 fxL 胶原 Q O jl ^ ^L)和 450 y L 无水乙醇。一 80°C 放置 30 min以上。 4.离心 10 min 沉淀 DNA，移去上清，用 2 0 0 斗 8 5 % 冰乙醇冲洗沉淀，离心去除残留的乙醇。 5.用1ug DEPC水溶解沉淀，取 4uL用于再扩增。除未标记的引物（10umol/L) 之外，再扩增反应须用与 FRAP-PCR 相同的 PCR 试剂。 PCR 循环条件为:94℃， 30 s; 54°C ， l mi n; 72 ℃， Imin; 30 个循环。 6.取 15 第二次 PCR 反应产物在1 % 的琼脂糖凝胶上进行电泳，用溴乙锭染 g确定插入片段的大小（见注释 11)。 7.用 TOPO® T A 克隆试剂盒（Inivtrogen) 将 PCR产物克隆人 pCR2.1 TOPO®载体，操作如下： 2 p i PCR产物， 0 •5 FL pCR2. I TOPO® 载体，〇.5 盐溶液（见注释 12)。 8.室温下孵育5 min, C 存于一2〇 °C 或直接进行转化（步骤 9〜12)。 9.将 2 连接产物和 25 One Shot® 感受态大肠杆菌（约半管）轻轻混匀（不可用移液器吹打混匀）。 10.冰浴 5〜30 min。 42°C加热 30 s, 立即转到冰上。 11.加入 125 juL SOC 培养基，在 37°C ，水平摇床 200 r/min 培养 I h。 12.取 50〜75 fxL 转化物在含有 5 0 鸿/^L 氨苄青霉素和 40 fxg/mL X-gal 的 L B 琼脂板上涂板， 37°C 培养过夜。 13.用移液枪头轻触三个白色克隆的边缘，将其分别溶于 50 水中，取 I 用M13 引物进行 PCR 反应，以鉴定阳性克隆。 14.从每一感兴趣的条带中选一阳性转化克隆，在 LB/氨苄培养基中 37°C 培养过夜。 15.用 Qiagen 的 QIAprep 小量质粒抽提试剂盒提取质粒并测序。 16.验证不同基因的表达（见注释13)。展开
注意事项	1.细胞培养需严格在无菌条件下进行。移去培养基后，培养板需立即放到干冰上或放置于一80°C 直至抽提 RNA。组织的收集必须用无菌、无 RNase 污染并用3 % 过氧化氢处理过的器具。组织样本需迅速冻存于干冰或液氮中，以防止R N A 的降解。另一选择是将组织剪切成直径小于〇.5 cm 的小块，贮存于 RNAlater (0.1〜0.2 g/mL, Ambion) 中，可于 4-C 存放一个月或_20°C 长期保存。这对于现场就地取样来说非常理想，省去了对干冰或液氮的依赖。 2.去除痕量的染色体 DN A 或其他来源的基因组 D N A 的污染是 FRAP-PCR 实验成功的关键。在扩增反应时基因组DNA 可与 cDNA 竞争导致 R N A 指纹图谱的假阳性结果。对这些假阳性结果的研究将浪费大量试剂和时间。我们用 Ambion的 DNA-Free K it 可去除单链和双链的基因组DNA，同时保持 RNA 模板的完整性。在随后的实时定量 PCR 反应中非转录反应的对照未出现任何扩增产物。这个试剂盒还有一个优点就是它包含一种新的去除 DNase 的试剂，可以除去DNase 和二价阳离子，以消除它们对后续反应的影响。 DNase 和二价阳离子的去除步骤非常迅速，且不需要有机溶剂的抽提、加入 ED TA 或热灭活（所有这些操作都可能影响 R N A 的完整性)。 3.每管分装适量的R N A 避免随后用于 cDNA 合成反应的R N A 反复冻融而影响R N A 的数量和质量。总 RN A 样品经过反复冻融后凝胶电泳显示条带的亮度会有所降低。 4.对 FRAP-PCR 实验最佳的总R N A 用量是通过用 200、 500、 750 和 1000 n g 预实验结果得到的。 750 ng 结果重复性最好，条带最清晰。但有时会遇到较高的噪声信号比，此时将 R N A 总量降至 375 n g 可消除背景噪声，改善条带的清晰度。 5.根据裂解液和裂解的组织类型，我们同时使用了不镑钢珠子和碳化钨珠子来匀浆组织。我们发现 TRIzoI 会腐蚀不锈钢珠子而 RNeasy 裂解液（Qiagen) 则不会。性腺、心脏和肝组织用碳化钨珠子匀浆解离效果较好，而脑组织和甲状腺则用不锈钢珠子较好。 6.cDNA 分装的原因正如 RNA 分装的原因：避免反复冻融导致降解。 20 的反应体系得到的 cDNA 如用于4 次 FRAP-PCR反应则中间会冻融 3 次，第三次时就会影响凝胶图谱，尤其是弱的条带。 7.第一链合成之后，要进行一步低保真度的PCR 步骤以利于随机引物结合到 PCR产物的两端。这一第二链合成步骤确保了后面高保真 PC R 中 cDNA 产物的最佳扩增效果。 8.决定 FRAP-PCR 中使用的具体的 1 8 碱基引物的最佳复性温度是非常重要的。A3、 B3 的理想退火温度是 54°C ，而 C3 则是 56°C 。如果研究者使用本章描述之外的 18碱基引物，则需在进行实验之前用分析软件（如 OligoanaIyzer) 确定其溶解温度、 G C 含量及最佳 PCR 温度。之后，再根据经验确定 PCR 条件。 9.在建立 FRAP-PCR 方法的初始阶段，罗丹明标记的PCR产物在电泳前并没有经过纯化。这导致所有上样孔都出现了大片的非特异性的条带（图 2a)。我们推测非特异性条带是由于多余的核苷酸和过剩的罗丹明所致。 QIAquick PCR 纯化试剂盒（Qiagen) 可回收 100 bp〜10 k b 的片段，并将小于40 b p 的片段去除。这种基于纯化柱的简易快速的方法对于除去拖尾，改善电泳结果的分辨率是非常有效的（图 2b)，应该用于所有的 FRAP-PCR实验。在未纯化的样品中，由于非特异性条带造成的背景会导致目的条带的丢失。 10.上样时尽可能不用靠近两边的 5 个孔。这些孔的电泳结果时常会出现拱形的条带，这使得与中间上样孔的结果很难比较。因为中间的上样孔通常分离效果较好，电泳条带清晰平整。同时，在不同处理组间空开 1〜2 个上样孔可避免电泳条带的弥散干扰。 11.罗丹明标记的 DNA 标准物并没有同时在测序胶上跑，因此，产物大小是在再扩增 PCR 步骤进行的。经过 6 h 的 1700 V 恒压电泳，在测序胶的中部切下的产物大小约在 300〜750 bp 之间。在大多数情况下，从测序胶切下的条带在再扩增 PCR 时只产生一个产物，可直接亚克隆至 TOPO 载体上。然而，一些看上去代表单一产物的条带在用于筛选的琼脂糖凝胶上会呈现多条带。这种共迁移率和非特异的扩增现象可从下面两方面来处理解决：（1）从琼脂糖凝胶上切割下与测序胶上条带大小相同的电泳条带，用 QIAquick P C R 纯化试剂盒(Qiagen) 纯化，亚克隆纯化产物或者（2）增加测序胶电泳的时间，以提高单个条带的分辨率，因为可能原来的条带代表了不止一个的PCR产物。 12.根据要进一步研究的潜在靶点的数量，•转化和克隆可能会在 FRAP-P C R 的实验成本中占相当的比例。我们发现克隆反应可以用推荐量一半的试剂进行。比如，在连接反应时只用 0.5 的载体，连接产物转化人半管（25 juL) 的感受态细菌。这样可节约试剂和成本而不影响 TOPO T A 克隆效率。 13.克隆完成后有好几种方法鉴定差异基因表达。我们选用了一种敏感度和可靠性最高的衡量 mRNA 相对表达量的实时定量 RT-PCR 方法（仪器为 MX4000,SYBR GREEN Master M ix 荧光染料）。实时定量 PCR 引物根据 FRAP-PCR获得的序列设计。 18SrRN A、卩-actin、甘油-3-礙酸脱氢酶（GAPDH) 作为内对照基因与目的基因的表达丰度相比较。展开

实验步骤

##一、从组织和培养细胞中分离RNA

1.TRIzol试剂（Invitrogen)。该试剂含有苯酚和硫氰酸盐化合物，操作时应穿实

验服，戴手套，存放于 4°C 。

2.氯仿。

3.异丙醇。

4.乙醇。

5.焦炭酸二乙酯（DEPC) 处理的水。

6.无DNA试剂盒（Ambion)。贮存于一 20°C 。

##二、 CDNA 合成

1.Superscript™ II， RNase H-反转录酶（200 U/(nL; Invitrogen)。一 20°C下可稳

定忙存两年以上。

2.5X 第一链合成缓冲液： 250 mmol/LTris-HCI， pH 8. 3， 375 mmol/L K C l, 15

mmol,L MgCl2，贮存于一 20。。。

3.0. lmmol/L 二硫苏糖醇（DTT)，贮存于一 20°C 。

4.dNTP 混合物： dNTP 各 1 0 mmol/L ，贮存于一20°C 。

5.18 碱基的随机引物（25 pmol/L ): A 3， 5'-AATCATGAGCTCTCCTGG——3';B3, 5』-CATACACGCGTATACTGG——3』； C3, 5'-CCATGCGCATGCATGAGA- 3 : 贮存于一20。。。

6.RNaseOMT™ 重组核糖核酸酶抑制剂 UOU/^L ; Invitrogen), I t 存于一20℃
##三、 FRAP-PCR

1.QiagenT叫 D N A聚合酶（5 U/|uL; Qiagen)， |^；存于一20。 C 。

2.Qiagen IOXPCR 缓冲液： Tris-HCl， KCl，（NH4)2SO4， 15 mmol/L MgCl2，p H 8.7, C 存于一20°C 。

3.25 mmol L MgCl2， I t存于一20°C 。

4.焦炭酸二异酯（DEPC) 处理过的水。

5.dNTP 混合物： dNTP 各 1 0 mmoL/L ， JC 存于一20° C 。

6.5'端用罗丹明标记的随机引物（lOfxmol/L ; A3、 B3 或 C3)，贮存于一20°C ，避光。

7.QIAquick PCR 纯化试剂盒（Qiagen)
##四、凝胶电泳

1.制胶溶液： 6 % 丙烯酰胺（29: 1 丙烯酰胺-bis丙烯酰胺），含 7 mol/L 尿素和1XTBE缓冲液。
2.1父丁6£缓冲液： 89 1^11 〇 1， 1 1 1 ^ 碱， 89 111111〇 1/1^硼酸， 2 111111〇 1/乙£0丁八二钠
盐， pH 8. 3。
3.上样缓冲液： 9 9 % 甲酰胺， I mmol/L EDTA， pH 8.0，〇. 〇〇 9% 二甲苯氰，0.009% 溴酚蓝。

4.TEMED。

5.25% 过硫酸铵。

6.FDD垂直电泳系统，包含 60孔梳子和低背景荧光的玻片（GenHunter)。

7.Sigmacote 桂胶液（Sigma-Aldrich)， JC存于 4°C 。

8.可提供电压>1700 V 的直流电源。

9.突光成像扫描仪： Typhoon 9210 可变模式成像仪（Amersham)。

10.可打印 llin X 17in® & 的喷墨打印机，用于打印实际尺寸的凝胶图像。

11.刀片。

##五、 PCR 产物的分离、再扩增和克隆

1.胶原（20 叫 ZmL), C 存于_20°C 。

2.3 mol/L 乙酸钠。

3.乙醇。

4.焦炭酸二乙酯（DEPC) 处理过的水。

5.PCR 试剂，见 2.3 (注意： lOfxmol/L 未标记的随机引物）。

6.TOPOTA® 克隆试剂盒（Invitrogen)。 OneShot® 感受态大肠杆菌贮存于—80°C , PCR TOPO® 克隆载体贮存于一2CTC。

7.SOC 培养基： 2 % 胰蛋白胨， 0 . 5 % 酵母提取物， 10 mmol/L NaCl， 2. 5 mmol/L KC1， 10 mmol/L MgCl2， 10 mmol/L MgSO4， 20 mmolZL 葡萄糖。

8.L B 培养基。

9.氨节西林（1 0 mg/mL)， JC存于一20°C 。

10.琼脂。

11.X-gal (20 mg/mL)，避光忙存于_2 〇 °C 。

12.M13 引物：正向（5'-GTAAAACGACGGCCA0 3 ' ) ，反向（5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3')，贮存于一20°C 。

13.QIAprep 离心法小量质粒抽提试剂盒（Qiagen)。3. 方法

##六、从组织或培养细胞提取 RNA

RNA可以从各种来源的样本包括培养的细胞（例如神经元细胞、肝细胞等）和组织中分离得到（见注释 1) 。 mRNA 的纯化对 FRAP-PCR 方法来说并不需要，因为mRNA 仅占细胞总 R N A 的 3 % 〜5 % (13)。因而在本章所描述的方法适用于可得到的总 RNA 有限的情况下（如少量的细胞或组织）。细胞总RNA易于纯化但在用于FRAP-PCR 前需用 DNase 处理（见注释2) 并根据每次的用量分装于一次性管子中(见注释3)。每次实验总RNA的使用量均约为750ng(见注释4)。
1.培养板每一孔的原代细胞（约 1.2 mg) 用 100 A TRIzoI 溶解，或每 50〜100mg 组织加 I mL TRIzol, 用勻浆器 Mixer Mill MM 300 (Retsch)和碳化鹤合金珠在 20 Hz 匀浆处理 2 min (见注释 5)。

2.将匀浆后的样品在室温放置 5 min，使得核蛋白复合体完全解离。

3.每 I mL TRIzo 丨加人 0. 2 mL 氯仿，用手剧烈振荡管子 15 s，室温放置 2〜3 min。

4.4°C 下 12 000 g■离心 15 min。

5.转移上层水相（约起始 TRIzol 体积的 6 0 % ) 至一新管中，按每 Im L TRlzoI 力口0.5 m L 的异丙醇，颠倒几次混匀。在室温放置 10 min, 然后 4°C ， 12 OOOg 离心 20 min。

6.移去上清，按每 I mL TRIzol 的初始用量用 I mL 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀，振荡混匀，并于 4°C , 7500 g 离心 5 min。

7.室温下干燥 RNA，用<100 fxL的 DEPC处理过的水溶解。

8.用分光光度计测定RNA浓度。

9.为了去除基因组 D N A 的污染，在 50 反应体系中按每1 0 鸿 R N A加 5 (uLDNase I 缓冲液和 I fxL 重组 DNase I (2 UZfjtL)。 37°C 孵育 20〜30 min。

10.加10 juL DNase I 灭活剂并在室温下放置2 min，然后 10 000 g 离心 I.5 min,将RNA转移人一新的离心管内。

11.再次测定RNA浓度，稀释至75 ng/fx L ，每管 IOfL 分装，于一 80°C保存。

##七、CDNA 合成

在这项技术中使用了 18 碱基的随机引物而非〇 lig0-d T 引物，以确保合成的反转录产物不偏向于3'端非翻译区。这使得内部包括可读框的 R N A序列可被反转录成cDNA，从而有利于下一步基因产物的鉴定。这点对于基因组序列未知的种属有特殊的意义（如银鸥、野鸭等)。同时，需设立不加反转录酶的对照，用以确定在随后的 PCR 实验步骤中是否有基因组 D N A 的污染（非反转录反应的对照， no RTcontro丨)。此外,商业化的 RNA (例如从转化的大鼠成纤维细胞来源的无D N A污染的总 RNA， GenHunter) 可作为反转录依赖的 mRNA 扩增反应的对照（contr〇l RNA)。

1.将 10 fzL 75 ng/juL 的总 RNA 和 I dNTP 混合物， I /xL 随机引物（A 3、 B3或〇 3; 25_〇 1/乙）混合。 65°(：孵育 5 111 丨 11 ，立即置于冰浴，稍加离心。

2.加入4 pL 5X 第一链合成缓冲液， 2 DTT, I pL R N A 酶抑制剂 RNase Out和 I /xL Superscript™ ] ! 反转录酶。

3.在 25°C孵育 10 min后于 42°C孵育 50 min.

4.70°C 加热 15 m in 以终止反应。

5.cDNA每管 5 分装，于一20°C保存，用于随后的 PCR 反应（见注释 6)。

##八、 FRAP-PCR

罗丹明是光敏性的染料，因此所有的操作过程均需要在暗处进行，包括引物、工作液及包含荧光标记物的 PCR 产物。

1.每个25 fxL的反应体系应包括： 5 pL cDNA, 2.5 fiL 10XPCR缓冲液， 1. 5 ，MgCl2， 0 •5 fJL dNTP混合物， 1. 25 ML 罗丹明标记的引物（A3、 B3 或 C3),0. I fxL Qiagen Tag DNA 聚合酶， 14 15 pL DEPC 处理过的水。

2.PCR参数设置：

3.将 PCR 产物保存于 4°C , 暗处避光。

4.用 Qiagen PCR 清洁试剂盒（QIAquick Nucleotide Removal kit) 纯化 PCR 产物(见注释9)。

5.加125 斗 PB缓冲液至25 ;xL PCR 产物中，混匀。

6.将QIAquick柱子放置于 2 m L 收集管中，把上一步混匀的样品加到柱子上，17 900 g离心 30〜60 s。

7.弃去过柱的液体，将纯化柱放回收集管中。

8.加 0 •75 m L 的 PE 缓冲液于纯化柱上，离心 30〜60 s。

9.将滤液弃去，纯化柱放回收集管，再离心 Im in 以除去残留的缓冲液。

10.将纯化柱放置于另一干净的L 5 mL 离心管中。

11.在柱子的膜中间位置加人3〇 fxL EB缓冲液，室温静置Im in, 离心洗脱DNA。

##九、凝胶电泳

1.将玻片的内表面擦拭干净，并用被液处理带有凹槽的玻片内表面。

装好玻片成「三明治」，将边缘封口以防胶聚合前泄漏。

2.配置 6 % 的变性聚丙烯酰胺凝胶。垂直电泳系统（长 45 cm, 宽 25 cm) 约需 50m L聚丙烯酰胺溶液。同时需加 1OO 新鲜配制的过硫酸铵和50 /xL TEMED并混勻。

3.将配置好的凝胶溶液沿着玻片上缘加人，插入加样梳，让其聚合过夜。在胶体溶液的上面盖上湿纸巾和保鲜膜防止溶液蒸发干。

4.聚合后，先在 1500 V 的电压下预电泳45 min。上下缓冲液槽共需用约750 mL IX T B E 电泳缓冲液。

5.将3〇 /iL PCR 产物和15 FDD上样缓冲液混匀，并设置恰当的对照（非转录反应的对照和control反转录依赖的mRNA扩増反应的对照），在 80°C 孵目 '2 min后取 5 juL上样（见注释 10)。上样前，用移液器冲刷每个上样孔。每份样品上样三个平行孔。

6.在 1700 V 电泳6 h 后，取出凝胶，根据对罗丹明的操作指南，用 Typhoon成像仪扫描（激发透镜为532 nm, 发射透镜为580 nm BP30)。确保非转录反应的对照加样孔泳道为空白，而反转录依赖的mRNA扩增反应的对照泳道有条带出现。

7.根据实际尺寸将凝胶图谱打印出来，将胶放于打印出的图谱上用保鲜膜包裹整块凝胶，以防止水分蒸发。

8.用干净的刀片将感兴趣的条带切下，重新扫描确定切割的是正确的条带。所切割获取的条带应该显示为有/无模式（图 1)。

##十、PCR产物的分离、再扩增和克隆

1.将割取的胶条置于I.5 m L离心管中，室温下用 1〇〇斗水浸泡10 min。

2.扣紧离心管盖子， >95°C孵育 15 min，离心 2 min。

3.转移上清到另一离心管；加入 IOyL 3 mol/L 乙酸钠， 2.5 fxL 胶原 Q O jl ^ ^L)和 450 y L 无水乙醇。一 80°C 放置 30 min以上。

4.离心 10 min 沉淀 DNA，移去上清，用 2 0 0 斗 8 5 % 冰乙醇冲洗沉淀，离心去除残留的乙醇。

5.用1ug DEPC水溶解沉淀，取 4uL用于再扩增。除未标记的引物（10umol/L) 之外，再扩增反应须用与 FRAP-PCR 相同的 PCR 试剂。 PCR 循环条件为:94℃， 30 s; 54°C ， l mi n; 72 ℃， Imin; 30 个循环。

6.取 15 第二次 PCR 反应产物在1 % 的琼脂糖凝胶上进行电泳，用溴乙锭染 g确定插入片段的大小（见注释 11)。

7.用 TOPO® T A 克隆试剂盒（Inivtrogen) 将 PCR产物克隆人 pCR2.1 TOPO®载体，操作如下： 2 p i PCR产物， 0 •5 FL pCR2. I TOPO® 载体，〇.5 盐溶液（见注释 12)。

8.室温下孵育5 min, C 存于一2〇 °C 或直接进行转化（步骤 9〜12)。

9.将 2 连接产物和 25 One Shot® 感受态大肠杆菌（约半管）轻轻混匀（不可用移液器吹打混匀）。

10.冰浴 5〜30 min。 42°C加热 30 s, 立即转到冰上。

11.加入 125 juL SOC 培养基，在 37°C ，水平摇床 200 r/min 培养 I h。

12.取 50〜75 fxL 转化物在含有 5 0 鸿/^L 氨苄青霉素和 40 fxg/mL X-gal 的 L B 琼脂板上涂板， 37°C 培养过夜。

13.用移液枪头轻触三个白色克隆的边缘，将其分别溶于 50 水中，取 I 用M13 引物进行 PCR 反应，以鉴定阳性克隆。

14.从每一感兴趣的条带中选一阳性转化克隆，在 LB/氨苄培养基中 37°C 培养过夜。

15.用 Qiagen 的 QIAprep 小量质粒抽提试剂盒提取质粒并测序。

16.验证不同基因的表达（见注释13)。

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注意事项

1.细胞培养需严格在无菌条件下进行。移去培养基后，培养板需立即放到干冰上或放置于一80°C 直至抽提 RNA。组织的收集必须用无菌、无 RNase 污染并用3 % 过氧化氢处理过的器具。组织样本需迅速冻存于干冰或液氮中，以防止R N A 的降解。另一选择是将组织剪切成直径小于〇.5 cm 的小块，贮存于 RNAlater (0.1〜0.2 g/mL, Ambion) 中，可于 4-C 存放一个月或_20°C 长期保存。这对于现场就地取样来说非常理想，省去了对干冰或液氮的依赖。

2.去除痕量的染色体 DN A 或其他来源的基因组 D N A 的污染是 FRAP-PCR 实验成功的关键。在扩增反应时基因组DNA 可与 cDNA 竞争导致 R N A 指纹图谱的假阳性结果。对这些假阳性结果的研究将浪费大量试剂和时间。我们用 Ambion的 DNA-Free K it 可去除单链和双链的基因组DNA，同时保持 RNA 模板的完整性。在随后的实时定量 PCR 反应中非转录反应的对照未出现任何扩增产物。这个试剂盒还有一个优点就是它包含一种新的去除 DNase 的试剂，可以除去DNase 和二价阳离子，以消除它们对后续反应的影响。 DNase 和二价阳离子的去除步骤非常迅速，且不需要有机溶剂的抽提、加入 ED TA 或热灭活（所有这些操作都可能影响 R N A 的完整性)。

3.每管分装适量的R N A 避免随后用于 cDNA 合成反应的R N A 反复冻融而影响R N A 的数量和质量。总 RN A 样品经过反复冻融后凝胶电泳显示条带的亮度会有所降低。

4.对 FRAP-PCR 实验最佳的总R N A 用量是通过用 200、 500、 750 和 1000 n g 预实验结果得到的。 750 ng 结果重复性最好，条带最清晰。但有时会遇到较高的噪声信号比，此时将 R N A 总量降至 375 n g 可消除背景噪声，改善条带的清晰度。

5.根据裂解液和裂解的组织类型，我们同时使用了不镑钢珠子和碳化钨珠子来匀浆组织。我们发现 TRIzoI 会腐蚀不锈钢珠子而 RNeasy 裂解液（Qiagen) 则不会。性腺、心脏和肝组织用碳化钨珠子匀浆解离效果较好，而脑组织和甲状腺则用不锈钢珠子较好。

6.cDNA 分装的原因正如 RNA 分装的原因：避免反复冻融导致降解。 20 的反应体系得到的 cDNA 如用于4 次 FRAP-PCR反应则中间会冻融 3 次，第三次时就会影响凝胶图谱，尤其是弱的条带。

7.第一链合成之后，要进行一步低保真度的PCR 步骤以利于随机引物结合到 PCR产物的两端。这一第二链合成步骤确保了后面高保真 PC R 中 cDNA 产物的最佳扩增效果。

8.决定 FRAP-PCR 中使用的具体的 1 8 碱基引物的最佳复性温度是非常重要的。A3、 B3 的理想退火温度是 54°C ，而 C3 则是 56°C 。如果研究者使用本章描述之外的 18碱基引物，则需在进行实验之前用分析软件（如 OligoanaIyzer) 确定其溶解温度、 G C 含量及最佳 PCR 温度。之后，再根据经验确定 PCR 条件。

9.在建立 FRAP-PCR 方法的初始阶段，罗丹明标记的PCR产物在电泳前并没有经过纯化。这导致所有上样孔都出现了大片的非特异性的条带（图 2a)。我们推测非特异性条带是由于多余的核苷酸和过剩的罗丹明所致。 QIAquick PCR 纯化试剂盒（Qiagen) 可回收 100 bp〜10 k b 的片段，并将小于40 b p 的片段去除。这种基于纯化柱的简易快速的方法对于除去拖尾，改善电泳结果的分辨率是非常有效的（图 2b)，应该用于所有的 FRAP-PCR实验。在未纯化的样品中，由于非特异性条带造成的背景会导致目的条带的丢失。

10.上样时尽可能不用靠近两边的 5 个孔。这些孔的电泳结果时常会出现拱形的条带，这使得与中间上样孔的结果很难比较。因为中间的上样孔通常分离效果较好，电泳条带清晰平整。同时，在不同处理组间空开 1〜2 个上样孔可避免电泳条带的弥散干扰。

11.罗丹明标记的 DNA 标准物并没有同时在测序胶上跑，因此，产物大小是在再扩增 PCR 步骤进行的。经过 6 h 的 1700 V 恒压电泳，在测序胶的中部切下的产物大小约在 300〜750 bp 之间。在大多数情况下，从测序胶切下的条带在再扩增 PCR 时只产生一个产物，可直接亚克隆至 TOPO 载体上。然而，一些看上去代表单一产物的条带在用于筛选的琼脂糖凝胶上会呈现多条带。这种共迁移率和非特异的扩增现象可从下面两方面来处理解决：（1）从琼脂糖凝胶上切割下与测序胶上条带大小相同的电泳条带，用 QIAquick P C R 纯化试剂盒(Qiagen) 纯化，亚克隆纯化产物或者（2）增加测序胶电泳的时间，以提高单个条带的分辨率，因为可能原来的条带代表了不止一个的PCR产物。

12.根据要进一步研究的潜在靶点的数量，•转化和克隆可能会在 FRAP-P C R 的实验成本中占相当的比例。我们发现克隆反应可以用推荐量一半的试剂进行。比如，在连接反应时只用 0.5 的载体，连接产物转化人半管（25 juL) 的感受态细菌。这样可节约试剂和成本而不影响 TOPO T A 克隆效率。

13.克隆完成后有好几种方法鉴定差异基因表达。我们选用了一种敏感度和可靠性最高的衡量 mRNA 相对表达量的实时定量 RT-PCR 方法（仪器为 MX4000,SYBR GREEN Master M ix 荧光染料）。实时定量 PCR 引物根据 FRAP-PCR获得的序列设计。 18SrRN A、卩-actin、甘油-3-礙酸脱氢酶（GAPDH) 作为内对照基因与目的基因的表达丰度相比较。

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